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暖暖暖鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
擴(kuò)全基因時(shí)翻轉(zhuǎn)錄用什么引物��？？？？？求大蝦~~！
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| 我比對(duì)了我要擴(kuò)的基因的全序列 ，發(fā)現(xiàn)5‘和3’都是保守的，全基因不長(zhǎng)就2000bp，于是我就在兩端最頂端設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，請(qǐng)問(wèn)我反轉(zhuǎn)錄時(shí)候用什么引物才能得到全長(zhǎng)呢？隨機(jī)引物是不是末端的序列不一定能反轉(zhuǎn)錄完全？？一步方法RT-PCR能解決問(wèn)題嗎？求大神解救，我是新手~~ |
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zhenwuhuang
至尊木蟲(chóng) (文學(xué)泰斗)
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking: 金幣+2, 感謝發(fā)帖應(yīng)助，幫助蟲(chóng)子 2013-08-10 18:14:31
gyesang: 回帖置頂 2013-08-10 23:43:11
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反轉(zhuǎn)錄引物有隨機(jī)引物、Oligo(dT)、基因特異性引物（GSP）三種。 使用oligo dT引物擴(kuò)增的產(chǎn)物, 可以保證擴(kuò)增產(chǎn)物包括mRNA的3'末端(減少rRNA的干擾), 但是oligo dT primer擴(kuò)增有一個(gè)問(wèn)題, 就是擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度和擴(kuò)增產(chǎn)物所包含的信息量的問(wèn)題, 之所以有長(zhǎng)度這個(gè)問(wèn)題,一方面和lz所提到的RNA完整性有關(guān),但最重要的限制在于逆轉(zhuǎn)錄酶的延伸能力. 用oligo dT primer擴(kuò)增可能出現(xiàn)擴(kuò)增出來(lái)的片段長(zhǎng)度短, 雖然都有mRNA的3'端, 但是序列信息多位于3'-UTR附近, 若擴(kuò)增序列太短,則有用信息很少, 不利于序列的識(shí)別和分析. 使用random primer, 也有片段長(zhǎng)度的限制, 但是由于它的逆轉(zhuǎn)錄并不一定在mRNA的末端起始, 而是在隨機(jī)位置起始,所以它的擴(kuò)增片段帶有更多CDS的信息.但是如果是用總RNA逆轉(zhuǎn)錄的話,有可能會(huì)受到rRNA的干擾. 至于Gsp,只是在擴(kuò)增已知gene/gene family以及部分原理的RACE中使用. |
3樓2013-08-10 15:57:35
暖暖暖
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2樓2013-08-10 15:41:27
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4樓2013-08-10 18:09:07
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