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兀自傷新蟲 (初入文壇)
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[求助]
蛋白膠
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本人新手一枚，最近配蛋白膠總是出現(xiàn)一些問題，如圖，膠中出現(xiàn)氣泡，最常見的是濃縮膠和分離膠之間出現(xiàn)氣泡。剛剛配出來沒有，往往是在4度放一天后就有了。請高手多多指教，謝謝！ IMAG0030.jpg IMAG0032.jpg |
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user59888
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
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是按照這個方法做的嗎 （1）10%AP（W/V）：:過硫酸銨（AP，引發(fā)劑） 0.1g，加蒸餾水至1.0mL，最好臨時配制。 （2）電泳樣品緩沖液：SDS 0.4g，巰基乙醇 1.0ml， 甘油 2.0ml， 0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8) 2.0 ml， 0.1%（W/V）溴酚藍 0.5ml，ddH2O 2.5ml。 （3）30.8%凝膠貯存液：稱Acr 30g及Bis 0.8g，溶于蒸餾水中，最后定容至100ml，過濾后置于棕色試劑瓶中，4°C貯存。 (4) 凝膠緩沖液 分離膠緩沖液：1.5mol/L pH 8.8 Tris-HCl。稱取18.15gTris，用60ml重蒸水溶解，再用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)至pH8.8，定容至100ml，4°C保存。 濃縮膠緩沖液：0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl。稱取6g Tris，用60ml重蒸水溶解，再用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)至pH6.8, 定容至100ml，4°C保存。 （5）10%SDS：將10g SDS溶于80ml蒸餾水中并輕緩攪拌（室溫低時需水浴加入溶解）。 （6）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS， 0.05mol/L Tris-0.384mol/L 甘氨酸緩沖液，pH8.3）：稱 Tris 3.03g， 甘氨酸14.41g，SDS 1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。 (7) 固定液：取50%甲醇455ml。冰乙酸45ml混勻。 （8）染色液：稱考馬斯亮藍R250 0.125g， 加上述固定液250ml，過濾后使用。 （9）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml。也可用250ml 95%乙醇，80ml冰乙酸，加ddH2O至1L。 （10）95%乙醇。 (1)配膠 貯備膠 (12.5%) 分離膠 (10%) 濃縮膠(4%) ddH2O 3.4ml 4.2ml 3.1ml Buffer 2.5ml 2.5ml 1.25ml Acr+Bis（30.8%） 4ml 3.2ml 0.7ml 10%SDS 100ul 100ul 50ul TEMED 6ul 6ul 4ul AP 100ul 100ul 50ul |
2樓2013-08-19 09:38:24
蔓海劫天
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3樓2013-08-20 08:00:11
兀自傷
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4樓2013-08-20 19:45:11
蔓海劫天
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跟你溶液配制比較下，只有濃縮膠濃度有點區(qū)別（我們是1.0mol/L)，這應該沒有啥大問題，其他都是差不多的。目測你圖片，問題還是在分離膠上，這里注意幾點：玻璃板一定要清洗干凈，確保無粘附，自然晾干，（可以用酒精擦拭）；SDS配制時要充分溶劑，制膠時SDS溶液沿玻璃壁流下，充分混合；注意AP的現(xiàn)配現(xiàn)用和TEMED的加入次序。 我把我們實驗室的情況簡述下，以便你參考：室溫下澆灌分離膠后，用水或異丙醇壓膠30min左右，后罐濃縮膠，室溫放置1~2h開始點樣點樣；另外是晚上10點左右制膠，方法同上，最后室溫放置過夜，第二天早晨開始點樣電泳。 實在不行，建議參考下《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)》相關教材，真誠祝你成功！自己的微薄之力，錯誤之處請勿吐槽！  |
5樓2013-08-21 08:17:32
feilinshiji
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6樓2013-09-23 09:22:41
火柴頭兒
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7樓2013-11-27 14:33:22
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