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[交流]
有關(guān)Ni Bestarose HP柱材的再生
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| 如題，我用的是Ni Bestarose HP柱材，純化His標(biāo)記的蛋白，初次使用的時(shí)候好像效果還好，目前目標(biāo)蛋白結(jié)合不上柱子，所以想問問有沒有關(guān)于Ni柱再生的方面的操作或者是手冊(cè)什么的，希望貢獻(xiàn)一下！謝謝各位！ |
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 Ni柱再生方法 |
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4樓2013-08-26 13:57:37
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396101466(金幣+1): 謝謝參與
396101466(金幣+1): 謝謝參與
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Ni 柱重生一般常用的步驟是： 1. ddH2O洗5CV，6M鹽酸胍洗1-2CV（這里流速慢點(diǎn)，浸泡也行的，我一般第一個(gè)CV泡1h，再加等體積的鹽酸胍浸泡2h），多洗點(diǎn)柱體積就更好了。如果填料實(shí)在很臟的話，可以用NaOH洗，但要先查找該款Ni柱的基架耐受的NaOH濃度。 2. ddH2O洗10CV，然后用100mM EDTA洗1-2CV（流速要慢點(diǎn)，要把Ni柱洗白，Ni充分的被EDTA螯合下來） 3. ddH2O洗10CV，然后用200mM NiSO4上柱1-2CV（流速要慢，讓Ni充分掛柱，或者1CV直接浸泡過夜也行） 4. ddH2O洗10CV，然后20%乙醇洗2CV，4度保存即可。 以上柱體積的量可以適當(dāng)增加點(diǎn)，效果更好點(diǎn)。 還有就是蛋白不掛柱子，不一定就是柱子的問題，有可能是蛋白本身的問題，也有可能是緩沖液不合適影響了蛋白的性質(zhì)。如果真是填料一點(diǎn)都不結(jié)合目的蛋白，那柱子得有多臟啊。。。。你可以取點(diǎn)柱子，加點(diǎn)loading buffer煮一下，跑個(gè)SDS-PAGE看看，是否上面殘留量很多蛋白，當(dāng)然柱子看起來得是藍(lán)色/綠色的，確認(rèn)還有Ni的存在。 |
2樓2013-08-22 13:42:14
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