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七八月的陽光銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
如何提高擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的效率 已有1人參與
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最近做擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，用的兩個(gè)質(zhì)粒（一個(gè)紅色熒光，一個(gè)綠色熒光）來轉(zhuǎn)化。效率很低，也有很多破裂。想請教各位： 1. 質(zhì)粒提取的方法是Tape-Arabidopsis Sandwich，但是試劑配制等又有參考了J Sheen方法的。應(yīng)該差別不大的吧。葉片狀態(tài)不穩(wěn)定，這個(gè)可能是關(guān)鍵，用的是弱光下的葉片，長得非常慢，起碼要6周才能長到J Sheen說的四周大小。不知道這個(gè)影響大不大。 2. 轉(zhuǎn)化后是放在光下的，16-24h都試過了，效率都沒有很高。到底是在光下好還是黑暗呢，時(shí)間多久合適呢？ 3. 在激光共聚焦觀察之前，轉(zhuǎn)化體系都一直保持在六孔板里面，但是這樣去檢測的時(shí)候濃度就太稀了，找細(xì)胞都要找好久，不知道能不能離心一下放管子里？這樣會(huì)不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂�。� 4. 我們的激光共聚焦是倒置的，我都蓋蓋玻片了，這個(gè)過程不會(huì)把細(xì)胞壓破吧？我在觀察的時(shí)候會(huì)看到有些細(xì)胞慢慢的在變形，剛看的時(shí)候還是圓的，很完整很漂亮，等到拍照完了葉綠體等都跑到一邊去了，這是什么原因造成的呢，有辦法解決嗎？ |
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七八月的陽光
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十分感謝你的答復(fù)啊。 我們實(shí)驗(yàn)室之前是沒有養(yǎng)擬南芥的，沒有專門種擬南芥的房間，現(xiàn)在是種在培養(yǎng)箱里面的。光周期13h11h，溫度22度，濕度60%左右。J Sheen說的是弱光，50個(gè)單位，我測了一下，在一個(gè)培養(yǎng)箱里面比較靠近燈的地方有30-40左右，有點(diǎn)太弱了，擬南芥長得也挺慢，我想可能是光照弱的原因。另一個(gè)培養(yǎng)箱可以調(diào)光強(qiáng)，但是種了以后也長得不太好，不知道是不是因?yàn)楣庹者�是太弱的原因。 還有我覺得我在上共聚焦之前用普通顯微鏡觀察原生質(zhì)體好像都還可以，但是隨著觀察時(shí)間延長，慢慢就在變形、破裂�？赡苁悄闾岬降膹�(qiáng)光照射有關(guān)系。因?yàn)槲抑皼]有離心，所以一個(gè)片子上的原生質(zhì)體很少，我都在熒光下找，這樣是不是也容易造成原生質(zhì)體的損傷？ 你說你們都是離心以后再去共聚焦觀察？是在六孔板里保持12-16h后，用100g離心，去掉上清再觀察？我試過一次把六個(gè)樣品都離心，但是越到后面破損就越多。是不是離心一個(gè)觀察一個(gè)比較好？ |
7樓2013-08-30 16:48:14
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4樓2013-08-25 13:36:17
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