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lsxx金蟲 (小有名氣)
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[求助]
用pPICZα A載體設(shè)計(jì)引物問題
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本人剛學(xué)做酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)，用的載體是pPICZα A，酵母菌是GS115，想表達(dá)一個基因片段大小在2.3kb的酶，想請教幾個關(guān)于引物設(shè)計(jì)的問題，在設(shè)計(jì)引物時，1，如果目的片段沒有Xho I酶切位點(diǎn)，是不是上游引物要帶的限制性內(nèi)切酶最好用Xho I啊，如果用了該酶，5‘端加了三個保護(hù)堿基，酶后面又加了AAAAGA Kex2蛋白酶切割位點(diǎn)，在后面是不是直接連接目的基因的5’端序列ATGNNNN就可以了？ 2，下游引物什么時候加（His）*6tag啊？pPICZα A載體本身不是含有（His）*6tag的嗎？ |
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20083630zhan
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【答案】應(yīng)助回帖
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貌似pPICZα A 的信號肽上面有Xhol 酶切位點(diǎn)，如果你的目的片段上面有Xho1 酶切位點(diǎn)的話，你酶切連接的時候，會將你的信號肽切掉，這樣，如果你的目的蛋白是分泌型的話，會影響你的分泌效率。如果的的目的蛋白需要純化，或者是進(jìn)行其他的實(shí)驗(yàn)，那么你的目的蛋白需要有His.6，這樣過鎳柱時候可以進(jìn)行純化，但是，這個不需要你加，載體本來就帶的，只要保證期間沒有終止子就可以了 |
2樓2013-08-27 20:11:21
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