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膠體金連成dimer
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zhenwuhuang
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3樓2013-09-09 18:00:22
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（一）膠體金的制備 1．制備方法膠體金的制備多采用還原法。氯金酸（HauC14）是主要還原材料，常用還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。根據(jù)還原劑 類型以及還原作用的強(qiáng)弱，可以制備0.8nm～150nm不等的膠體金。 最常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法。 具體操作方法如下： （1）將HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。 （2）攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入一定量的1％檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O）水溶液。 （3）繼續(xù)加熱煮沸15min。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過(guò)程約2～3min。 （4）冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。 用此法可制備16～147nm粒徑的膠體金。金顆粒的大小取決于制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉的量。 （二）免疫金的制備 1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至選定值。原則上可選擇待標(biāo)記蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，也可略為偏堿。但通常最適反應(yīng)pH往往需經(jīng)多次試驗(yàn)才能確定。 在調(diào)節(jié)膠體金的pH值時(shí)應(yīng)注意，膠體金會(huì)阻塞pH計(jì)的電極，不可直接將電極插入膠體金溶液中，宜先用終濃度為0.15的聚乙二醇（PEG，20000）穩(wěn)定膠體金后，再膠體金的pH值。 2．將1/10體積的合適濃度的蛋白質(zhì)溶液加于膠體金溶液中，放置室溫反應(yīng)2～5min。 由于鹽類成分能影響膠體金對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，并可使膠體金聚沉，因此待標(biāo)記蛋白質(zhì)溶液若含有較高的離子濃度，應(yīng)在標(biāo)記前先對(duì)低離子強(qiáng)度的蒸餾水透析去鹽。 3．加入濃度為0.2％的PEG或BSA以飽和游離的膠體金。 4．離心分離，去除上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。離心條件視膠體金顆粒的粒徑而異：對(duì)5nm金顆�？蛇x用40000r/min離心1h；8nm金顆粒用25000r/min離心45min；14nm金顆粒用25000r/min離心30min，40nm金顆粒用15000r/min離心30min。 5．輕吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的緩沖液懸浮，恢復(fù)原體積后再離心。如此洗滌2～4次。以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)。 6．免疫金復(fù)合物最終用稀釋液配制成工作濃度保存。稀釋液通常是加入穩(wěn)定劑的緩沖液。緩沖溶液常用中性的PBS或Tris緩沖液。 多種蛋白質(zhì)、葡聚糖、PEG2000、明膠等均為良好的高分子穩(wěn)定劑，PEG和BSA是最常用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有兩大作用：一為保護(hù)膠體金的穩(wěn)定性，使之便于長(zhǎng)期保存；二為防止或減少免疫金復(fù)合物的非特異性吸附反應(yīng)。穩(wěn)定劑的合理選擇是十分重要的，不適當(dāng)?shù)姆�(wěn)定劑有時(shí)也會(huì)導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。 |
2樓2013-09-09 17:35:36
zhenwuhuang
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A6 D-DIMER金標(biāo)法檢測(cè)操作規(guī)程 http://wenku.baidu.com/view/6a68df1514791711cc791778.html |
4樓2013-09-09 18:05:16
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5樓2013-09-09 18:09:49
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