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seasonin銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
蛋白相互作用，釣取受體
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我想用帶his-tag的蛋白釣出細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體，也就是研究蛋白之間的相互作用，準(zhǔn)備用his-pulldown，目前有純化的蛋白，已經(jīng)透析至水中，還有提好的細(xì)胞膜，細(xì)胞膜提取是用的生工的試劑盒，里面有DTT和蛋白酶抑制劑。 目前我有預(yù)裝的純化柱，我準(zhǔn)備把純化好的蛋白重新上NI柱，或者把柱子里的填料取出來(lái)（以便后面與膜蛋白孵育），我想應(yīng)該是用buffer把填料處理，然后用純化的蛋白與填料孵育，buffer洗幾遍后離心收集珠子，然后在用細(xì)胞膜與柱子孵育，再用含有500mM咪唑的buffer洗幾遍后離心收集珠子，最后用SDS-PAGE的上樣buffer與珠子混合，煮沸離心取上清點(diǎn)樣吧 目前有幾個(gè)疑惑，希望能夠得到指點(diǎn) 1.都說(shuō)pulldown的假陽(yáng)性高，那我該怎么設(shè)置對(duì)照呢？ 2.關(guān)于處理填料的buffer有沒(méi)有什么參考呢？ 3.能不能提供一些實(shí)驗(yàn)中需要注意的細(xì)節(jié)呢？ 再次表示感謝 |
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sun_in_night
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| 我也是做蛋白相互作用的，但pulldown的部分由實(shí)驗(yàn)室其他人負(fù)責(zé)，所以沒(méi)法給你很詳細(xì)建議。研究蛋白相互作用，任何單一方法都存在一定缺陷，最好由多種方法相互驗(yàn)證，譬如我們組一對(duì)蛋白相互作用分別要通過(guò)酵母mbsus，pulldown以及BiFC三種方法驗(yàn)證。 |
2樓2013-09-09 21:42:57
seasonin
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