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下雨沒(méi)有傘銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
關(guān)天T載體中藍(lán)白斑的問(wèn)題
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本人最近做T載體實(shí)驗(yàn)，做了幾次都沒(méi)有成功，現(xiàn)和各位大俠交流求教。 最近一次的實(shí)驗(yàn)困擾: 細(xì)菌復(fù)蘇后分別鋪菌和搖菌----鋪菌出現(xiàn)白斑和藍(lán)斑，白斑大于５０% ----搖菌菌液也變渾濁了。 下一步：挑白斑劃線----劃了三個(gè)平板，均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng) 分析：挑白斑少了。白斑太小 下一步：從冰箱取出再培養(yǎng)了４小時(shí)（藍(lán)白斑平板） 挑白斑劃線----一次取二到５個(gè)白斑劃一個(gè)平板，共計(jì)劃三個(gè)平板 結(jié)果還是無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，有一個(gè)全是藍(lán)斑 分析：挑菌時(shí)有可能挑到藍(lán)斑，對(duì)搖菌試管進(jìn)行細(xì)菌擴(kuò)增。 下一步：對(duì)搖菌試管取10ul加2mlLB+2ulAMP進(jìn)行再搖菌擴(kuò)增 下一步：對(duì)搖菌試管和擴(kuò)增的試管各取100ul用煮沸法用目的片段的引物 PCR進(jìn)行驗(yàn)證，電泳加目的DNA作陽(yáng)性對(duì)照和Maker,結(jié)果有和陽(yáng)性對(duì)照一樣 的條帶。 下一步：對(duì)擴(kuò)增的試管進(jìn)行鋪菌----分別10^3,2*10^3,4*10^3 的稀釋倍數(shù) 三個(gè)平板，結(jié)果三個(gè)平板均是藍(lán)斑，無(wú)白斑。 困擾的問(wèn)題： １ 第一次有藍(lán)白斑，為何劃線分不出白斑？搖菌培養(yǎng)過(guò)，液體清亮。 ２ 驗(yàn)證有目的DNA片段的存在，后續(xù)鋪菌中為何全是藍(lán)斑？ 我的分析： １白斑可能是其它DNA片段污染---但是即使污染，劃線也應(yīng)該有白斑出現(xiàn)呀 ----有沒(méi)有不含DNA片段的白斑呢？----按藍(lán)白斑篩選的原理是不可能的呀 ２驗(yàn)證細(xì)菌中有目的DNA片段的存在，鋪菌全是藍(lán)斑，可能目的片段的細(xì)菌 含量太少，沒(méi)有出現(xiàn)，----但是三個(gè)平板都沒(méi)有白斑，可能性太小了 ３LB平板的配制有問(wèn)題，我只想到出現(xiàn)了藍(lán)斑那么X-GAL和IPTG應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題， AMP是否有影響還不清楚。 請(qǐng)教各位有經(jīng)驗(yàn)的朋友們幫我分析一下呀，我快被罵死了，做了這么久沒(méi)有做出來(lái) |
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下雨沒(méi)有傘: 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-01-03 08:39:48
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樓主邏輯好強(qiáng)，看的我最后有點(diǎn)小亂了，僅就最后一些個(gè)人感覺(jué)發(fā)表點(diǎn)小看法哈！ 1) 涂板有不長(zhǎng)菌，應(yīng)該抗生素是沒(méi)有問(wèn)題的。涂板后有藍(lán)斑，表明X-GAL和IPTG也沒(méi)有問(wèn)題，應(yīng)該不是試劑出了錯(cuò)； 2) 藍(lán)白斑篩選過(guò)程是有假陽(yáng)性情況出現(xiàn)的，即使長(zhǎng)了白班，也不一定是自己的目標(biāo)質(zhì)粒。有可能是PCR非特異擴(kuò)增小片段（電泳無(wú)法檢測(cè)到）的連接產(chǎn)物，但這種情況，一般菌液PCR就可以檢測(cè)到并排除； 3）藍(lán)斑有時(shí)候可能會(huì)是目標(biāo)產(chǎn)物，藍(lán)白斑篩選應(yīng)該是插入片段破壞了載體自身的讀碼框，如果片段不大，或者片段插入未能改變讀碼框，就很有可能出現(xiàn)藍(lán)色陽(yáng)性克隆。 4） 可以加長(zhǎng)菌體在平板上的培養(yǎng)時(shí)間，讓菌斑長(zhǎng)大一點(diǎn)，同時(shí)加長(zhǎng)菌板在冰箱的誘導(dǎo)時(shí)間，這樣顯色比較方便觀察和排除。 暫時(shí)就這些吧，別的原因我也不大清楚，不過(guò)看樓主的意思，已經(jīng)得到陽(yáng)性克隆了，為何還要鋪板子？直接送公司測(cè)序就好了；還有就是，畫(huà)線培養(yǎng)就是為了純化菌斑的，如果挑4-5個(gè)畫(huà)個(gè)板子，有點(diǎn)繞圈子了！ 祝好，大家相互學(xué)習(xí)，共同進(jìn)步！ |
2樓2013-09-14 14:06:27
cicelyzh
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有些混亂。藍(lán)白斑篩選是有假陽(yáng)性的可能。所以需要挑白斑再進(jìn)一步鑒定。你說(shuō)挑白斑再次劃線后不長(zhǎng)是什么意思？你的板不是同時(shí)做的嗎？為什么初始的平板長(zhǎng)菌而再次劃線的不長(zhǎng)？配置平板時(shí)的LB沒(méi)有錯(cuò)的話，amp注意要等培養(yǎng)基冷卻至45-50°C后再添加。 挑菌不可能少吧，一個(gè)克隆里是一個(gè)細(xì)菌經(jīng)N次繁殖后的總和。理論上說(shuō)一個(gè)細(xì)菌都可以長(zhǎng)的。 |
3樓2013-09-14 22:49:54
下雨沒(méi)有傘
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4樓2013-09-16 17:17:49
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首先感謝你提供的經(jīng)驗(yàn)和線索---藍(lán)斑也可能是目標(biāo)產(chǎn)物。 我還沒(méi)有找到陽(yáng)性克隆，只是PCR驗(yàn)證了菌液里面有陽(yáng)性克隆。 我現(xiàn)在是要提純陽(yáng)性克隆。如果它是藍(lán)斑的話，我就沒(méi)有辦法了。 我在繼續(xù)做這一次的實(shí)驗(yàn)，徹底證實(shí)了失敗以后我再放棄。 挑４-５個(gè)的原因：是因?yàn)榍耙淮翁魡慰寺](méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。 我分析：是不是我挑的幾個(gè)單克隆有問(wèn)題呢？為了驗(yàn)證我的想法，我挑了４-５個(gè)劃平板，又挑了幾個(gè)單克隆搖菌。結(jié)果都沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。 為什么白斑不長(zhǎng)菌，這是我最想不通的地方？ 希望多和你交流學(xué)習(xí)  指導(dǎo)一下。 |
5樓2013-09-16 17:38:35
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現(xiàn)在感覺(jué)最需要解決的問(wèn)題是獲取陽(yáng)性克隆，而不是找原因，鑒于此，我感覺(jué)還是這樣做比較好些： 1） 如果藍(lán)斑菌液擴(kuò)增結(jié)果顯示陽(yáng)性，且擴(kuò)增大小與自己的目標(biāo)基因大小一致（如果你擴(kuò)增的產(chǎn)物長(zhǎng)度是你目的基因全長(zhǎng)的話，可以從長(zhǎng)度上篩選），可以考慮送一兩個(gè)樣品直接測(cè)序，看序列是否為目標(biāo)序列； 2） 還是用傳統(tǒng)方法連接的話，最好再設(shè)計(jì)一對(duì)新的引物，可以在原來(lái)引物的外側(cè)，特異性要高，作為備用引物，可能新引物效果會(huì)好些！ 3） 如果更換克隆方式，可以咨詢老師同學(xué)，在別人的幫助下開(kāi)展下步工作，邊做邊學(xué)習(xí)。 4） 考慮到因素太多，片段本身、試劑、操作細(xì)節(jié)等等都可能影響結(jié)果，所以最快捷的方式是把你的引物和模板給別的做的比較成功的朋友，并把你的程序和之前PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果、凝膠回收結(jié)果的圖片發(fā)給他做以參考，讓別人重復(fù)，看是夠有效果，至于現(xiàn)在遇到的問(wèn)題，最好以后再細(xì)說(shuō)； 小木蟲(chóng)有帖子說(shuō)：實(shí)驗(yàn)一直做不順，休息了三四天，做了個(gè)重復(fù)，出來(lái)結(jié)果了！好復(fù)雜！ |
7樓2013-09-17 08:11:16
下雨沒(méi)有傘
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10樓2013-09-23 21:11:18
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