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avex514鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
P糖蛋白的western blot條件
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因畢業(yè)在即，所以正抓緊時(shí)間完成畢業(yè)課題。其中需要用western blot分析對阿霉素耐藥的MCF-7/ADR的P糖蛋白含量。采用碧云天的膜蛋白提取試劑盒對細(xì)胞提取膜蛋白，然后用5Xloading buffer對蛋白進(jìn)行處理，按照公司提供的條件，70度水浴加熱10min，上樣量20微克，140V電泳，轉(zhuǎn)膜液加了10%的甲醇，轉(zhuǎn)膜條件是100V，90min，5%加了TBST脫脂牛奶封閉2h，一抗用的ABcam的ab80594，4度過夜，TBST清洗6次，每次5min，二抗室溫孵育1h，TBST清洗6次，每次5min，顯色，沒有明顯的條帶，只是目的條帶區(qū)域是一片黑色的（見下圖1）。這個(gè)條件是公司推薦的條件，當(dāng)然自己之前也試過很多條件，耗時(shí)4個(gè)月，沸水煮10min，上樣量20微克，80V電泳，轉(zhuǎn)膜條件用過很多，260mA 60或120min，100V 60，120或240min，300mA 60（下圖2），90或120min等，結(jié)果都是如此。 請問各位大神，這是一抗的問題嗎？ 現(xiàn)在考慮換抗體，abcam有兩個(gè)抗體ab170903和ab170904都感覺可以，官網(wǎng)的說明上條帶很明顯，但是奇怪的是P糖蛋白的分子量是170 kda，但是abcam的抗體說明書上寫的都是141kda，而官網(wǎng)上ab170903的條帶出在250的位置上，ab170904的條帶出在170的位置上，這個(gè)合理嗎？ab170903能做流式，免疫組化和WB，ab170904只能做免疫組化和WB，但是ab170903只能識別人緣性的樣品如細(xì)胞，但是ab170904除了適用于人緣性的樣品外，還能適用于大鼠和小鼠來源的樣品。二者鏈接分別如下： http://www.abcam.cn/p-glycoprotein-epr10363-antibody-ab170903.html http://www.abcam.cn/mdr1-epr10364-antibody-ab170904.html 麻煩大家?guī)臀曳治鱿聠栴}，并且提下建議，該選擇哪個(gè)抗體好點(diǎn)，在下已被折磨很久了，只求盡快解決問題！ 圖1.jpg 圖2.jpg |
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1.這個(gè)蛋白是糖基化蛋白，所以用ab80594做出的條帶是正常的�？梢赃m當(dāng)調(diào)整一抗稀釋度，條帶會稍微干凈些。 2.至于你說的170KD還是141KD的問題，這里我確信說是170KD的，ab170903和ab170904都是epitomics的產(chǎn)品，開發(fā)過程中band都在170KD左右，因?yàn)槲覀冇玫奶荻饶z，所以在 150－250KD間的比例和實(shí)際位置不會是那么精確， 3.ab80594不是epitomics的產(chǎn)品，所以不太清楚開發(fā)過程。，這兩個(gè)產(chǎn)品都挺好，其中ab170904的QC結(jié)果WB結(jié)果不錯(cuò)，這個(gè)我更推薦一些，作為WB應(yīng)用。 |
2樓2013-09-16 12:21:32
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6樓2014-03-13 00:54:22
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