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lx0103新蟲 (小有名氣)
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[求助]
用易錯(cuò)PCR和In-Fusion技術(shù)構(gòu)建突變文庫(kù)為什么不成功？ 已有1人參與
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首先我用高保真的酶（NEB公司的Phusion酶）擴(kuò)增目的片段（設(shè)計(jì)引物時(shí)使得目的基因的5'-末端分別與線性化載體末端含有15bp同源區(qū)段），然后將純化后的PCR產(chǎn)物（切膠回收）與純化后的線性化載體（切膠回收）用Clontech公司的In-Fusion酶連接并轉(zhuǎn)化天根公司的TOP10感受態(tài)細(xì)胞，平板上出現(xiàn)上百個(gè)菌落，陽(yáng)性克隆率達(dá)到75%。 然后我用易錯(cuò)PCR產(chǎn)物（同源區(qū)段也是15bp）與上述同樣的線性化載體用In-Fusion酶連接并轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，易錯(cuò)PCR片段和載體的處理方法都是切膠回收，并且回收后的濃度都一樣，即線性化載體50ng/ul、PCR片段100ng/ul，都是用NEB公司的1kb DNA Ladder定量的，結(jié)果平板上只長(zhǎng)1-2個(gè)克隆，不知道這是怎么回事？ 易錯(cuò)PCR條件是：0.2mM dATP和dCTP,1mM dGTP和dTTP,7mM MgCl2,0.5mM MnCl2,并且是用保真性低的普通Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，不知道會(huì)不會(huì)是因?yàn)閿U(kuò)增后3‘末端的A尾巴影響了同源重組反應(yīng)？但是Clontech公司的In-Fusion酶的說(shuō)明書上說(shuō)，PCR產(chǎn)物3’末端有無(wú)A并不影響啊。我現(xiàn)在也是找不出原因，為什么用高保真的PCR酶可以做出來(lái)，而低保真性的PCR酶做就做不出來(lái)呢？ |
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2樓2013-10-28 11:54:55
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3樓2016-03-17 21:31:25
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