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[求助]
請(qǐng)教140KD蛋白的轉(zhuǎn)膜條件
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| 請(qǐng)教各位前輩，最近在做 TLR7140kd的蛋白，試過(guò)的轉(zhuǎn)膜條件有恒壓100v（電流在236ma左右）,轉(zhuǎn)2小時(shí)；橫流300ma(電壓在135v左右)2小時(shí)，轉(zhuǎn)完膜后用麗春紅染膜，可以看到170kd的蛋白條帶，用的是（10-170kd）的Marker，但顯影的時(shí)候我的目的條帶沒(méi)有出現(xiàn)，用的一抗是CST的推薦濃度1：1000,1:800，均試過(guò)，二抗1:5000，1:8000，1:9000,1：10000，140kd的條帶始終沒(méi)有出現(xiàn)，170kd的條帶卻壓出來(lái)了，雖然條帶很細(xì)，而且背景也很深請(qǐng)問(wèn)各位前輩我的轉(zhuǎn)膜條件有問(wèn)題嗎？還是需要提高一抗?jié)舛龋繎?yīng)該如何改進(jìn)，請(qǐng)各位前輩不吝賜教，謝謝，急急急！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-10-06 02:02:23
Silenceli: 金幣+10, ★★★很有幫助 2013-10-06 22:52:08
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Silenceli: 金幣+10, ★★★很有幫助 2013-10-06 22:52:08
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Cst的抗體一般沒(méi)問(wèn)題，不過(guò)還是建議樓主可以過(guò)表達(dá)下蛋白，檢測(cè)下抗體特異性以及到底多大。還有內(nèi)源蛋白最好轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，10%膠可以恒流50毫安。然后一抗過(guò)夜。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
2樓2013-10-06 00:24:31
ljsh
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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3樓2013-10-06 08:28:25
4樓2013-10-06 22:51:56
5樓2013-10-06 22:54:56
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7樓2013-10-06 23:01:44
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助！ 2013-10-07 01:30:50
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你那170大小的也有可能就是你的目的條帶。不知道你用的是什么蛋白MARKER，你可以確定你顯出來(lái)的條帶是170kDa嗎？ 如果想增強(qiáng)信號(hào)的話。不知道你用的是什么細(xì)胞裂解緩沖液，比如說(shuō)你可以直接用LOADING BUFFER去裂解細(xì)胞，這樣裂解比較充分。還有THERMO（以前的PIERCE）出一種super ECL的底物，可以增強(qiáng)信號(hào)。 不過(guò)還是建議你最好能拿到個(gè)質(zhì)粒，這樣可以確定那170的是否是你的目的條帶。你可以考慮去找已經(jīng)發(fā)表過(guò)文章的作者要，一般都會(huì)給，或者你去ADDGENE看看。買(mǎi)一個(gè)質(zhì)粒也不貴 祝好運(yùn) |
8樓2013-10-06 23:27:13
9樓2013-10-06 23:36:02
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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-10-29 09:51:45
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你用的是10%的還是8%的膠？marker分的開(kāi)嗎？ 我看了下cst的database，他們那除了140的還有其他的帶，你的能看到嗎？還有他們可以在hela細(xì)胞中檢測(cè)到140的帶。這個(gè)細(xì)胞你們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有吧。下次跑電泳時(shí)帶上hela的細(xì)胞裂解液作對(duì)照。還抗不出來(lái)就得考慮抗體問(wèn)題了（不過(guò)話說(shuō)回來(lái)，用過(guò)很多cst得抗體基本上沒(méi)出現(xiàn)過(guò)問(wèn)題）。 |
10樓2013-10-07 03:10:03
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