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blueghost2新蟲 (小有名氣)
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[求助]
測(cè)序問(wèn)題
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| 我做的實(shí)驗(yàn)是重組載體的構(gòu)建，雙酶切驗(yàn)證都是對(duì)的，然后測(cè)序測(cè)了好多次，每次都是說(shuō)有重疊現(xiàn)象導(dǎo)致不能測(cè)序，我問(wèn)測(cè)序公司什么是重疊現(xiàn)象，他說(shuō)樣本中干擾較大測(cè)序失敗，真是糾結(jié)都測(cè)了一個(gè)多月了，那位高人指點(diǎn)一下啊�。。。。�！急急急�。。。。� |
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2樓2013-10-09 11:13:53
nuoyaeva
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-10-09 14:16:52
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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-10-09 14:16:52
是不是你的目的蛋白有比較接近的isoform啊，我最近在構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒，雙酶切沒(méi)問(wèn)題，但是把質(zhì)粒做模板PCR的時(shí)候，隱約看到是兩條相近的帶重疊在一起。因?yàn)樾蛄泻芙咏�，沒(méi)辦法分離開，然后測(cè)序的時(shí)候就經(jīng)常測(cè)不出來(lái)，因?yàn)槲沂亲约簻y(cè)序，所以我反復(fù)多次分節(jié)測(cè)序，才基本確定獲得的目的條帶是我需要的…  |
3樓2013-10-09 11:47:12
blueghost2
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4樓2013-10-09 16:55:49
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5樓2013-10-09 16:57:09
r529887327
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6樓2013-10-09 17:50:26
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blueghost2: 金幣+5, ★有幫助 2013-10-10 10:27:47
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我們實(shí)驗(yàn)室有部分實(shí)驗(yàn)會(huì)涉及檢測(cè)突變情況，所以我們自己有2臺(tái)測(cè)序儀器。我看了樓上說(shuō)的，其中第二點(diǎn)，如果PCR產(chǎn)物很干凈，那測(cè)序基本就不會(huì)有問(wèn)題，可排除；至于回紋結(jié)構(gòu)，那個(gè)更不是問(wèn)題了，我經(jīng)常檢測(cè)B細(xì)胞S區(qū)和V區(qū)的突變情況，基本上屬于重復(fù)序列最多的sequence，的確回紋結(jié)構(gòu)以及重復(fù)序列會(huì)產(chǎn)生干擾，但是不會(huì)完全測(cè)不出來(lái)，我覺(jué)得也不太可能是這種情況。想來(lái)想去，覺(jué)得只有這種分子量基本一致的isoform，或者是你樣本不純。 |
7樓2013-10-09 20:19:12
blueghost2
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8樓2013-10-10 09:32:21
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分子量一致的可能性不大，因?yàn)槲乙p酶切。非目的基因不可能那么巧也有這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，所以和載體鏈接的可能性就更小了。樣本不純，這個(gè)我也考慮了，覺(jué)得可能是雜菌污染，但后來(lái)我也很注意這方面，應(yīng)該不會(huì)每次都污染，再說(shuō)里面都有抗生素，其它菌也不容易生長(zhǎng)啊，哎，怎么這么悲劇，竟遇見(jiàn)這種情況。�！，F(xiàn)在我考慮的是測(cè)序用的引物是否有問(wèn)題，但是測(cè)序公司用的是通用引物，說(shuō)我的引物沒(méi)問(wèn)題，我現(xiàn)在就更糾結(jié)了。。。。。。。 |
9樓2013-10-10 09:38:41
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