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[求助]
固定液的種類和應(yīng)用
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| 請問大蝦，固定液都有哪些，各自的優(yōu)缺點是什么。如果要利用切片技術(shù)來開展免疫蛋白方面的研究是需要何種固定液，需要透明么？ |
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COCO_Xiao瀾
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【答案】應(yīng)助回帖
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1．單一固定液的性質(zhì)和用途 （1）乙醇（C2H5OH）（ethylalcohol） ：又名酒精，可沉淀白蛋白、球蛋白、核 蛋白， 后者易溶于水， 所以經(jīng)酒精固定的標本對細胞核染色不良。 酒精可溶解脂肪、 類脂體， 所以不能用酒精固定脂肪。酒精可沉淀肝糖，但仍可溶解于水，因此肝糖經(jīng)酒精固定后不能 在低于 70％酒精中保存。單獨固定使用酒精的濃度應(yīng)為 95—100％。無水酒精滲透力較差， 并且能使組織收縮，在與醋酸、氯仿混合使用時，可增強它們的穿透力。酒精除固定作用外，還具有硬化和脫 水的作用，固定后的組織可保存于 70％酒精中，所以酒精在制片過程中用途很大。無水乙 醇容易揮發(fā)，又容易吸收空氣中的水分，所以瓶蓋必須塞緊，為了吸去其中水分，最好在無 水乙醇瓶內(nèi)放入少量無水硫酸銅粉末。酒精是一種還原劑，不能與重鉻酸鉀、鋨酸等氧化劑 混合使用。 （2）甲醛（HCHO）（formeldehyde）：是一種氣體，溶于水成為甲醛水溶液或稱福爾馬林，一般使用濃度為 10％福爾馬林（formalin）液，其配法是取市售的甲醛液 10ml 與 90ml 蒸餾水混合即可，實際上其含量只有 4％甲醛。這樣的配法已成為一般實驗室常用 的慣例。 甲醛不能沉淀白蛋白及核蛋白，但能與蛋白質(zhì)化合。它是一種應(yīng)用廣泛，使用 簡單的固定液，具有穿透力強、固定均勻、組織收縮小、硬度適當，適用于一般器官組織的 固定及保存。尤其對脂肪、神經(jīng)組織固定效果較好。更適于病理組織的制片及大體積標本的 保存，一般組織需固定 24 小時以上，固定后的組織可移入 50％酒精中逐步脫水。 甲醛是一種強還原劑，不能與鉻酸、重鉻酸鉀、鋨酸等氧化劑混合，因極易被 氧化為甲酸。在配混合固定液時，如海利氏液等需臨用前再加入，24 小時后失效。 甲醛由于長期貯存，特別是低溫氣候，容易產(chǎn)生多聚甲醛，即溶液中的白色沉 淀，在高溫下又成為甲醛。不純的甲醛易產(chǎn)生甲酸，使溶液變?yōu)樗嵝�，影響核的染色。所�?在備用的福爾馬林中加入小量的醋酸鈣、碳酸鎂或大理石作為中和劑�？捎孟路ㄅ渲� 10％ 中性甲醛溶液， pH 為 7.0 左右： 40％甲醛 100ml 蒸餾水 900ml 磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O） 4.0g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4） 6.5g 甲醛醋酸鈣溶液： 40％甲醛 10ml 醋酸鈣 2g 蒸餾水 加至 100ml. （3）醋酸（CH3COOH） （aceticacid） 純醋酸在低溫時結(jié)成冰狀故又名冰醋酸，約在 17℃時融化，能和水及乙醇混合。使用濃度為 0.3—5％，它能很好地沉淀核蛋白，對 染色質(zhì)的固定效果很好。 醋酸對染色體的保存能接近生活狀態(tài)， 因此在固定染色體的固定液 中幾乎都含醋酸。醋酸的穿透力很強。它能使組織膨脹，常與其他藥劑配合使用，起抑制其他固定劑對組織收縮的作用。 醋酸破壞線粒體和高爾基體， 所以在線粒體和高爾基體制片及固定液中都不用 醋酸。 （4）苦味酸（C6H2（NO2）3OH）（picricacid） ：是一種強酸，呈黃色結(jié)晶， 溶于水、乙醇、苯和二甲苯。干燥時能自燃，爆炸，所以需濕性保存。一般配成飽和水溶液備用（100ml 蒸餾水加 1.2g 苦味酸）。 苦味酸能沉淀蛋白質(zhì)，對胞質(zhì)固定較好�？辔端岬拇┩噶苈�，能使組織強烈 收縮，一般都與醋酸等藥劑配合使用。苦味酸固定的組織會出現(xiàn)黃色，可在低度酒精中加入 少量碳酸鋰飽和水溶液，洗去黃色。如遺留少許黃色在組織中，對染色無影響。 （5）重鉻酸鉀（K2CrO7） （potassium dichromate） ：呈橙紅色結(jié)晶，可溶于水，有毒，是強氧化劑，不應(yīng)和乙醇混合。 它穿透力強，能使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗苄�，能保持細胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)與生活狀態(tài)相仿，并用于線粒體 和高爾基復(fù)合器的固定，但需與甲醛、氯化汞等混合使用，是細胞學良好的固定劑。重鉻酸 鉀固定的組織需經(jīng)流水沖洗 12—24 小時。 （6）鉻酸（H2CrO4） （chromicacid） ：為強氧化劑，是一種弱酸，呈紅色或淺 褐色結(jié)晶，極易潮解，所以最好配成 1％的水溶液保存。它是強烈的沉淀劑，不單獨使用。 硬化程度中等。固定肝糖 的效果優(yōu)良， 它使肝糖不溶于水。 在固定線粒體和高爾基復(fù)合器的固定液中都含有 鉻酸成分。 鉻酸穿透力較慢，不使組織收縮。固定后的組織需經(jīng)流水沖洗 12 小時以上， 洗去鉻酸，否則會發(fā)生沉淀，影響染色。 （7）氯化汞（HgCl2） （mer cury bichloride） ：又稱升汞，呈白色針狀結(jié)晶，能升華，是一種極毒的藥品，對粘膜有 腐蝕作用，使用時需特別當心。 氯化汞能沉淀一切蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)變性不溶于水，對一般染色效果很好，對 固定線粒體和高爾基體的效果也很好。 氯化汞穿透力較弱，收縮力較大，所以一般與醋酸、甲醛等混合使用。經(jīng)氯化 汞固定的組織會產(chǎn)生氯化亞汞沉淀， 所以組織或切片需用 0.5％碘酒處理 3—5 分鐘， 除去沉 淀物，然后用 2％硫代硫酸鈉水溶液去碘處理 1—2 分鐘。 （8）四氧化鋨（OsO4） （osmiuln tatroxide） ：又名鋨酸（osmicacid） 。是一種淡黃色結(jié)晶體，為強氧化劑，不可與酒 精、甲醛混合，在配制使用過程中瓶皿需特別潔凈，固定濃度為 1—2％水溶液。需用棕色 瓶貯存于 4℃冰箱內(nèi)。 鋨酸是固定脂肪的最好固定劑。穿透速度很慢，能均勻固定蛋白質(zhì)，能保持細 胞生活時形態(tài)，不引起細胞收縮，對細胞質(zhì)的保存較好，特別適用于線粒體、高爾基復(fù)合器 的固定。固定后的透明處理，用苯為透明劑可得良好的切片效果。 鋨酸價格極貴，毒性高，蒸氣易損傷眼睛及粘膜，使用時應(yīng)加小心。 鋨酸固定的組織切片，不易被蘇木精著色，需經(jīng)過漂白處理。 Lacour 漂白液的配制： 20％H2O2 10ml 80％酒精 30ml 將切片置此液中漂白 4—12 小時，移入 80％酒精、70％酒精、50％酒精中各 2 分鐘，蒸餾水充分洗滌后，再進行染色。 以上簡單的固定液各有優(yōu)缺點，如無水酒精可固定肝糖，但不能固定脂肪，因 脂肪易溶于酒精。 而鋨酸能固定脂肪， 氯化汞對蛋白質(zhì)固定較好， 冰醋酸可以固定核蛋白等， 它們只是對細胞的某些成分固定較好，而不能將所有成分都保存下來。如果互相配合使用， 則能取長補短，得到較好的固定效果，只有了解藥品的性質(zhì)，才能清楚各固定液的性能。下 面介紹幾種常用的混合固定劑。 2．混合固定液的配制和性能 （1）包音氏（Bouin’s）固定液 ） 苦味酸飽和水溶液 75ml 甲醛（40％） 25ml 冰醋酸 5ml 本液在使用前配制。 包音氏液為常用的良好固定劑， 適用于無脊椎動物， 組織學、 胚胎學均可應(yīng)用。 滲透力迅速，固定均勻，組織收縮少。小塊組織固定 2—12 小時，一般組織固定 12—24 小 時，固定后用 50％酒精洗滌數(shù)次。 此液固定的組織適于蘇木精、伊紅等染色。用馬瑞氏三色染色，能得艷麗的圖 像。 （2）任克氏（Zenker's）固定液 ） 重鉻酸鉀 2.5g 氯化汞 6g 蒸餾水 100ml 冰醋酸 5ml 配制時將重鉻酸鉀、氯化汞溶于加溫的蒸餾水，冰醋酸臨用前加入。此固定液 適用于細胞學、組織學的研究工作。固定時間一般需 12—24 小時。固定后要用流水沖洗 12 小時，用碘去汞。此液固定的組織適于一般染色，細胞核、細胞質(zhì)染色較為清晰。 （3）海利氏（Helly's）液 重鉻酸鉀 2.5g 氯化汞 6g 蒸餾水 100ml 40％甲醛液 5ml 此固定液是將任克氏配方中的冰醋酸換成甲醛液， 甲醛也在用前加入， 因在加 入甲醛 24 小時后即生成沉淀而失效。固定時間 12—24 小時。海利氏液為骨髓、脾、肝等造 血器官的較好固定劑。此液亦可保存線粒體，染色前需用碘去汞。 （4）蘇薩氏（Susa's）[海登哈音氏（Heidenhain's）] 液： 氯化汞 4.5g 氯化鈉 0.5g 40 ％甲醛液 20ml 三氯醋酸 2g 冰醋酸 4ml 蒸餾水 80ml 將 4.5g 氯化汞和 0.5g 氯化鈉溶于 80ml 蒸餾水中保存。臨用前取此液 20ml， 加入三氯醋酸 0.5g，40％甲醛 5ml，冰醋酸 1ml，混合使用。 此液含有三氯醋酸和氯化鈉，對較硬的組織有軟化作用，如皮膚、蛔蟲卵、昆 蟲幼蟲等角質(zhì)層較厚的組織，食道、胃均能適用。它具有滲透快、收縮小的優(yōu)點。小塊組織 固定 3—5 小時；大塊組織，如皮膚固定 12—24 小時。固定后可直接入 95％酒精洗滌，勿 入水或低度酒精，否則易使膠原纖維膨脹。切片在染色前，用碘去汞。 （5）卡諾氏（Carnoy's）液 純酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 此液穿透力強，對核固定優(yōu)良，是細胞學制片常用的固定液。酒精能固定胞漿 及沉淀肝糖，冰醋酸能固定染色質(zhì)并防止酒精過度硬化和收縮，氯仿可增加滲透力。小白鼠 的睪丸和馬蛔蟲的子宮固定需 30—50 分鐘，稍大一些的淋巴結(jié)、胸腺等組織，可固定 1—2 小時。時間太長易使組織過度硬化，不利于切片。固定后直接入 95％酒精洗滌，然后脫水、 透明、包埋。 （6）酒精、甲醛（簡稱 A．F）液 95％酒精 90ml 40％甲醛 10ml 如需要可加入 0.5g 的醋酸鈣使其呈中性。此液有固定兼脫水的作用，用于病 理快速診斷的制片，也適于肥大細胞的固定。2—3mm 厚的病理組織在 50℃固定 40 分鐘， 一般室溫固定 12—20 小時，固定后可直接入 95％酒精脫水。 固定液的種類很多， 用時可查閱制片方面的書籍。 首先要根據(jù)實驗?zāi)康模?選用固定液。 但應(yīng)用時必須首先了解各種混合固定液中的組成成分能否預(yù)先混合， 固定后是 否需要洗滌，然后再開始配制固定液。 |
3樓2013-10-10 18:09:47
sayaya
鐵桿木蟲 (正式寫手)
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2樓2013-10-09 13:20:07
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