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toxemia新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于一氧化氮或一氧化氮合成酶的檢測(cè)問(wèn)題
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我將一段一氧化氮合成酶的基因轉(zhuǎn)染進(jìn)了細(xì)胞。現(xiàn)在想檢測(cè)一下它的表達(dá)。有沒(méi)有同學(xué)做過(guò)一氧化氮合成酶或一氧化氮的檢測(cè)？我查到一氧化氮合成酶可以用elisa，western，還有南京建成生物研究所的一氧化氮合成酶檢測(cè)試劑盒，說(shuō)是用的比色法，我沒(méi)太明白這個(gè)比色法出來(lái)的結(jié)果是什么樣的？觀(guān)察顏色的深淺嗎？有沒(méi)有同學(xué)做過(guò)？ 一氧化氮的檢測(cè)也是有試劑盒，分熒光法和比色法�？墒且谎趸皇俏⑷苡谒�？怎么收集呢？在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不會(huì)損失嗎？ 有做過(guò)這個(gè)的同學(xué)請(qǐng)給我個(gè)建議？哪個(gè)方法比較好，并且比較經(jīng)濟(jì)。我只要能證明我轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)得比沒(méi)轉(zhuǎn)染的多就行了。半定量就好。 |
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yang0071
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2樓2013-10-11 16:57:39
yang0071
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wizardfan: 金幣+3, 感謝詳細(xì)解答 2013-10-13 07:50:16
wizardfan: 金幣+3, 感謝詳細(xì)解答 2013-10-13 07:50:16
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使用說(shuō)明： 1. 取出Griess Reagent I和II，使回復(fù)室溫。 2. 用待測(cè)樣品所用溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品(1-100μM)。 例如樣品為細(xì)胞培養(yǎng)液上清，細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM＋10%FBS，則用DMEM＋10%FBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。通常標(biāo)準(zhǔn)品 的濃度可取0, 1, 2, 5, 10, 20, 40, 60, 100μM。 3. 按50μl/孔，在96孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品及樣品。 樣品為培養(yǎng)液上清，可以直接取樣，如果有可沉淀物則需離心后取上清。如樣品為細(xì)胞或組織，可以快 速凍融裂解，然后離心沉淀取上清，體積不足50μl可以用重蒸水或0.9%NaCl稀釋(相應(yīng)地標(biāo)準(zhǔn)品也需用 重蒸水或0.9%NaCl稀釋)。細(xì)胞或組織也可以用用于Western或IP的裂解液(無(wú)需添加抑制劑)裂解，同樣 標(biāo)準(zhǔn)品也需相應(yīng)稀釋。碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)或各種RIPA裂解液裂解細(xì)胞后適用 于一氧化氮的測(cè)定。 4. 按50μl/孔，在各孔中加入室溫Griess Reagent I。 5. 按50μl/孔，各孔中加入室溫Griess Reagent II。 6. 540nm 測(cè)定吸光度。 如無(wú)540nm濾光片，520-560nm的濾光片也可。如無(wú)酶標(biāo)儀或合適的濾光片，也可以通過(guò)目測(cè)比色，確定 樣品中一氧化氮的濃度。目測(cè)比色時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品需要更為精細(xì)的濃度梯度。 |
3樓2013-10-11 16:58:50
toxemia
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4樓2014-03-30 10:32:29
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