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遨游生命

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[交流] 有沒(méi)有人驗(yàn)證過(guò)這篇文章的數(shù)據(jù) 已有3人參與

小蟲(chóng)在做實(shí)驗(yàn)時(shí)，查到了中科大田志剛教授在PNAS上的一篇文章，剛好有小鼠TLR3和TLR4這兩個(gè)基因的引物，于是直接參考來(lái)用。結(jié)果這兩個(gè)基因的引物都不好用，TLR4直接擴(kuò)增不出來(lái)，TLR3明顯具有非特性擴(kuò)增。不知道有沒(méi)有蟲(chóng)友也參考過(guò)這篇文章的引物序列做過(guò)這兩個(gè)基因的擴(kuò)增？或許是我的實(shí)驗(yàn)條件不合適？但是我用的是溫度梯度檢測(cè)，TLR3在幾個(gè)溫度下有明顯非特異性擴(kuò)增，此外的溫度范圍下沒(méi)有特異性擴(kuò)增。請(qǐng)各位蟲(chóng)友賜教，小蟲(chóng)不勝感激啊原文鏈接地址http://www.pnas.org/content/102/47/17077.full.pdf+html

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1樓 2013-10-15 09:15:16

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hl16010921

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-10-16 19:32:02

1.LZ做PCR之前即使用文獻(xiàn)的引物也要先做blast和primer打分，即使是高水平文獻(xiàn)引物寫(xiě)錯(cuò)的概率也是很高的。
2.PCR條件的摸索是比較鬧心的，耐心的反復(fù)做，試試加DMSO，甘油之類(lèi)的。
3.模板質(zhì)量如何？PCR條件再好，模板差也不行呀。

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4樓2013-10-16 15:58:15

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DAX1

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kx444555: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2013-10-16 09:11:06

樓主，要找到和你一樣參考的概率應(yīng)該極小哦。不知道你是做克隆還是半定量。換個(gè)酶試試，話說(shuō)我這么多年做了大大小小克隆不下50個(gè)基因，從來(lái)沒(méi)用過(guò)溫度梯度檢測(cè)，一直堅(jiān)持用kod和phusion這兩個(gè)酶。實(shí)在不行就發(fā)信問(wèn)問(wèn)他們具體實(shí)驗(yàn)操作唄，一般都會(huì)給回的。
Ps，八年前上過(guò)老田的免疫課，還是很不錯(cuò)的。

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2樓2013-10-16 04:20:15

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elbo

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直接聯(lián)系作者，請(qǐng)教一下。

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3樓2013-10-16 15:34:44

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引用回帖:

4樓: Originally posted by hl16010921 at 2013-10-16 15:58:15
1.LZ做PCR之前即使用文獻(xiàn)的引物也要先做blast和primer打分，即使是高水平文獻(xiàn)引物寫(xiě)錯(cuò)的概率也是很高的。
2.PCR條件的摸索是比較鬧心的，耐心的反復(fù)做，試試加DMSO，甘油之類(lèi)的。
3.模板質(zhì)量如何？PCR條件再好，模 ...

出這兩個(gè)基因?yàn)檫€有內(nèi)參基因一個(gè)引物。這個(gè)內(nèi)參基因的引物擴(kuò)增的特異性很好。不知道為什么差別很大

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5樓2013-10-16 17:13:25

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