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西北農(nóng)林科技大學(xué) Nat Commun 發(fā)布鋅指打靶生產(chǎn)抗病轉(zhuǎn)基因牛新策略
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來自西北農(nóng)林科技大學(xué)的研究人員成功利用鋅指切口酶（zinc-finger nickases,ZFN）介導(dǎo)將溶葡萄球菌素（lysostaphin）基因插入到β-酪蛋白（beta-casein）基因座，由此構(gòu)建出了活產(chǎn)基因靶向性克隆牛。這一突破性的研究成果發(fā)表在10月14日的《自然通訊》（Nature Communications）雜志上。 領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是西北農(nóng)林科技大學(xué)的張涌（Yong Zhang）教授，其多年從事哺乳動(dòng)物發(fā)育生物工程理論和技術(shù)研究。是國家級(jí)“有突出貢獻(xiàn)專家”。 ZFN是一種適用于基因組工程操縱、實(shí)現(xiàn)定向突變的強(qiáng)有力的工具。ZFNs切割DNA，在基因組中生成位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂(DSBs)�；蛲ㄟ^非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)雙鏈斷裂，往往會(huì)在連接斷點(diǎn)導(dǎo)入短的插入或缺失(indels)，或是通過同源重組修復(fù)（HDR）拷貝姐妹染色單體忠實(shí)地修復(fù)原始序列。盡管非同源末端連接是高等真核細(xì)胞和生物體主要的雙鏈斷裂修復(fù)信號(hào)通路，目前研究人員利用了這兩種信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因組修飾。 當(dāng)前，ZFNs被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，但由于不可避免地生成雙鏈斷裂以及非同源末端連接的易出錯(cuò)性，利用可編程核酸酶進(jìn)行基因組工程操縱受到限制。并且，這些可編程核酸酶往往會(huì)在高度同源的位點(diǎn)誘導(dǎo)出隨機(jī)生成及不需要的缺失。而且核酸酶誘導(dǎo)太多脫靶雙鏈斷裂對(duì)細(xì)胞有害。此外，要正確地分離出基因靶向細(xì)胞也不是件容易的事情。 克服這些局限的一種潛在策略就是，靶向性導(dǎo)入到包含一個(gè)單鏈斷裂（SSB）或切口的DNA中。像雙鏈斷裂一樣，單鏈斷裂/切口理論上可以刺激同源重組修復(fù)信號(hào)通路。與雙鏈斷裂相比，切口或SSB不是非同源末端修復(fù)的底物。因此，靶向性SSB有潛力將修復(fù)限定至同源重組修復(fù)信號(hào)通路。 溶葡萄球菌素可由溶血性葡萄球菌自然生成，已有人提出用它來進(jìn)行全身性治療溶血性葡萄球菌感染。在小鼠模型中，溶葡萄球菌素已被證實(shí)能夠?qū)谷苎云咸亚蚓鸬娜橄傺�。有研究�?bào)道，乳汁中表達(dá)溶葡萄球菌素的轉(zhuǎn)基因牛能夠抵抗溶血性葡萄球菌乳房感染。然而在體外采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞生成的溶葡萄球菌素由于糖基化有可能發(fā)生蛋白質(zhì)失活。因此，修改編碼序列生成Gln125,232-溶葡萄球菌素確保了兩個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)被移除。這可以防止蛋白質(zhì)糖基化并恢復(fù)部分蛋白質(zhì)活性。 在新研究中，研究人員的目的旨在通過在牛胚胎成纖維細(xì)胞內(nèi)將外源性Gln125,232溶葡萄球菌素基因插入到β-酪蛋白基因座中，進(jìn)行有效、可重現(xiàn)的基因靶向，從而使得基因靶向牛的乳腺能夠生成溶葡萄球菌素蛋白。 研究人員隨后證實(shí)了，在牛胚胎成纖維細(xì)胞中將ZFNickases靶向內(nèi)源β-酪蛋白基因座，通過同源重組修復(fù)刺激可添加溶葡萄球菌素基因。他們發(fā)現(xiàn)，ZFNickase處理細(xì)胞可成功用于體細(xì)胞核移植，生成了活產(chǎn)的基因靶向牛（gene-targeted cow）。并且，這些基因靶向牛的乳汁中分泌溶葡萄球菌素，體外分析證實(shí)這種牛奶能夠殺死金黃色葡萄球菌。研究人員表示，在這一策略上取得的成功將推動(dòng)新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)讓農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)獲益。 生物通：何嬙 原文鏈接及摘要： http://www.nature.com/ncomms/201 ... ull/ncomms3565.html Zinc-finger nickase-mediated insertion of the lysostaphin gene into the beta-casein locus in cloned cows Zinc-finger nickases (ZFNickases) are a type of programmable nuclease that can be engineered from zinc-finger nucleases to induce site-specific single-strand breaks or nicks in genomic DNA, which result in homology-directed repair. Although zinc-finger nuclease-mediated gene disruption has been demonstrated in pigs and cattle, they have not been used to target gene addition into an endogenous gene locus in any large domestic species. Here we show in bovine fetal fibroblasts that targeting ZFNickases to the endogenous β-casein (CSN2) locus stimulates lysostaphin gene addition by homology-directed repair. We find that ZFNickase-treated cells can be successfully used in somatic cell nuclear transfer, resulting in live-born gene-targeted cows. Furthermore, the gene-targeted cows secrete lysostaphin in their milk and in vitro assays demonstrate the milk’s ability to kill Staphylococcus aureus. Our success with this strategy will facilitate new transgenic technologies beneficial to both agriculture and biomedicine. 作者簡(jiǎn)介： 張涌 研究方向: 物克隆與轉(zhuǎn)基因技術(shù)、動(dòng)物胚胎工程 個(gè)人簡(jiǎn)歷: 1987年7月—1987年12月，西北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)系任助教。 1987年12月—1990年2月，西北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)系攻讀博士學(xué)位。 1990年2月—1990年6月，西北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)系任講師。 1990年6月—1992年12月，西北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)系任副教授、碩導(dǎo) 。 1993年1月—1999年9月，西北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)系任教授、博導(dǎo)。 1999年9月—2007年9月，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院任教授、博導(dǎo)。 2007年9月至今，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院教授、博導(dǎo)。 科研項(xiàng)目： 1.良種牛胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)研究與開發(fā)，項(xiàng)目編號(hào)：20061666。國際科技合作項(xiàng)目，2008-2010年，總經(jīng)費(fèi)73萬元。項(xiàng)目主持人。 2. 體細(xì)胞高效克隆技術(shù)研究，863重點(diǎn)課題，2008-2010年，總經(jīng)費(fèi)950萬元。課題主持人。 3. 抗病轉(zhuǎn)基因牛新品種培育，項(xiàng)目編號(hào)：2008ZX08007-004。 榮譽(yù)及獎(jiǎng)項(xiàng)： 國家級(jí)“有突出貢獻(xiàn)專家”，“做出突出貢獻(xiàn)的中國博士學(xué)位獲得者”，”國家“百千萬人才工程”入選者。 獲得部省級(jí)科技進(jìn)步獎(jiǎng)5項(xiàng)，中國青年科技獎(jiǎng)、霍英東青年教師獎(jiǎng)、中華農(nóng)業(yè)科教獎(jiǎng)農(nóng)業(yè)科研獎(jiǎng)各一項(xiàng)。 社會(huì)兼職： 兼任國務(wù)院學(xué)位委員會(huì)學(xué)科評(píng)議組成員，陜西省學(xué)位委員會(huì)委員、陜西省政府決策咨詢委員會(huì)特邀委員、陜西省政協(xié)委員，陜西省動(dòng)物學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)，陜西省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)。 [ Last edited by victorlau on 2013-10-18 at 18:39 ] |
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