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rzhdw銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于大腸桿菌彗星實驗
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各位大俠，鄙人非生物專業(yè)，參照文獻(xiàn)方法嘗試了E.COLI的中性條件彗星實驗，但在顯微鏡觀察的時候發(fā)現(xiàn)熒光比較微弱，且細(xì)胞看起來只有一個小點(diǎn)，完全看不到文獻(xiàn)中的那種拖尾的形狀。不知道是不是我的顯微鏡不行？本人用的是萊卡DMRX，濾光片組H3, BP 420-490/RKP 510/LP 515, 照相機(jī)為Nikon DXM 1200F, 目鏡10X, 物鏡40X. 另外，文獻(xiàn)中說SYTO9染料可能熒光強(qiáng)度不夠，需要用YOYO-1染料。但是手頭上沒有，買又太貴了。。。有沒有好心人可以交換的？我這里有Invitrogen Live/dead 熒光試劑盒。 附上實驗流程： 1. 玻片預(yù)處理：用滅菌水（或0.85%生理鹽水）配制1%常熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，加熱溶解并冷至55度，將中間有透明窗口的磨砂玻片酒精浸泡并灼燒后，預(yù)熱至55度，采用浸漬法涂板，60-70度干燥15min 2.第一層膠（選做）：0.85%鹽水配制0.5%常熔點(diǎn)瓊脂糖，加熱熔融后55-60度保溫，吸取200ul加入預(yù)處理的玻片上，蓋上蓋玻片，4度放置10min，移去蓋玻片 3.第二層膠：瓊脂糖同步驟2，取200ul瓊脂糖與2ul 107cfu/ml 菌液混合，取100ul混合液加至第一層膠上，蓋上蓋玻片，4度放置10min，移去蓋玻片 4.第三層膠：加入200ul常熔點(diǎn)瓊脂糖，含有5 ug/ml RNase A, 1 mg/ml lysozyme，0.25% 月桂酰肌氨酸鈉，上蓋玻片，4度放置10min，37度培養(yǎng)30 min 5.裂解：裂解液為2.5M NaCL, 100 mM EDTA四鈉, 10 mM Tris PH10, 1%月桂鈉，實驗前加入1% Triton X-100，室溫攪拌至少10 min，將膠片浸入該溶液中室溫裂解1 h。 6.酶消解：2.5M NaCL, 10 mM EDTA，10 mM Tris PH7.4, 1 mg/ml （或0.5-0.6 mg/ml）蛋白酶K(不含DNAse)，37度培養(yǎng)2h。 7.電泳：電泳液為300 mM 醋酸鈉，100mM TrIs（PH 9）,膠片首先在該溶液中平衡20 min，12V電泳1h（0.4 V/cm, 100 mA）。將玻片先后浸入1 M醋酸銨乙醇溶液20 min（5 ml 10M 醋酸銨加入45 ml 無水乙醇），無水乙醇中30 min，70%乙醇10 min，室溫晾干。 8.染色及觀察：染色前膠片先吸取50ul新鮮配制的5% DMSO及10 mM NaH2PO4, 滴加至玻片上，在玻片還是濕潤狀態(tài)時加入50 ul 20uM SYTO 9 (in 5% DMSO), 用熒光顯微鏡觀察，放大倍數(shù)400X,激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長510 nm. |
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2樓2013-10-26 10:32:14
wrq910214
銀蟲 (初入文壇)
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3樓2015-07-25 10:11:35
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- 專業(yè): 微生物遺傳育種學(xué)
4樓2020-07-08 17:03:59
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