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dengqiong301木蟲 (小有名氣)
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binding assay，有做過(guò)的看過(guò)來(lái)
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小蟲最近在做一個(gè)受體的binding assay，本來(lái)看著protocol很簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)做起來(lái)卻是困難重重。 話說(shuō)是研究某一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)的受體，突變了其中幾個(gè)可能涉及到與對(duì)應(yīng)激素結(jié)合的位點(diǎn)，想用放射性標(biāo)記的方法來(lái)測(cè)定下binding效率。 問(wèn)題就開始出現(xiàn)了，試了幾次，都沒有成功，問(wèn)題羅列如下： 1 提取的cytosol的濃度太低，用了大概5-10個(gè)million的細(xì)胞/樣本，用的是binding buffer （25mM Tris, 10%甘油，1mM EDTA, 20mM Na2MnO4, Protease Inhibitior以及5mM DTT）,低速離心收集細(xì)胞后，凍融三次，振動(dòng)破碎細(xì)胞，100 000 g 4℃離心1小時(shí)取上清，測(cè)定蛋白濃度，蛋白的濃度特別低（用的是BCA測(cè)定法），只有不到1mg/ml。 2 做binding assay時(shí)，取了30微升的cytosol, 10微升的buffer (對(duì)照組用的是未標(biāo)記的激素，400倍)，10微升的tracer （3H，50nM）,4度孵育2.5個(gè)小時(shí)后，加5mg dextran-coated的charcoal去除free的放射性激素，快速離心后取30微升測(cè)定radioactive count。得到的結(jié)果反而是對(duì)照組比較高，所有的結(jié)果基本上都是這個(gè)樣子，所以就比較迷糊，請(qǐng)各位有經(jīng)驗(yàn)的大神指點(diǎn)迷津，不甚感激。 |
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木蟲 (小有名氣)
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