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406587521新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
在做RGA為標(biāo)記的分子標(biāo)記試驗(yàn)，可是一直出不來(lái)結(jié)果，求有經(jīng)驗(yàn)的師兄師姐指點(diǎn)！
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在做RGA做標(biāo)記的分子標(biāo)記試驗(yàn)，但是條帶特別少，只有在1000bp左右才有條帶，其他分子量的地方都沒(méi)有條帶或者很淺。。。 試驗(yàn)大體這樣做的： 50 μL PCR體系包括10×buffer 5 μL，25 mM 氯化鎂10 μL，2.5 mM dNTPs 4 μL,1U Taq 酶0.4 μL，引物 60ng，模版40ng。 程序是：94度5min，40個(gè)循環(huán)包括94度1min，45度1min，72度2min，最后72度7min，12度10min。 產(chǎn)物8 μL+3 μL 95%甲酰胺上樣緩沖液，95℃煮5min，上樣5μL，5%變性PAGE分離，1600v，70w預(yù)電泳，1400v，60w電泳到溴酚藍(lán)跑至3/4為止。 銀染。 我有一對(duì)引物，它們的相對(duì)分子質(zhì)量不一樣，一個(gè)是6616.4，一個(gè)是1308.6，其中后者帶有一個(gè)次黃嘌呤修飾，引物工作濃度為10 uM，引物加入量為60ng，前者加入1μL，后者0.5 μL。 圖是最近跑出來(lái)的一個(gè)。 _B274338.JPG |
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