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彭清LC新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
分子實(shí)驗(yàn)遇到了瓶頸 求助！
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| 我是做定點(diǎn)突變的 |
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zh10246
鐵桿木蟲(chóng) (文壇精英)
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3樓2013-12-02 18:54:39
彭清LC
新蟲(chóng) (初入文壇)
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剛剛做分子實(shí)驗(yàn)，有些地方可能操作不當(dāng)，請(qǐng)大神指教！ 我的載體構(gòu)建成功了，雙酶切的時(shí)候載體和目的基因的條帶都有，設(shè)計(jì)引物做定點(diǎn)突變，PCR之后跑膠驗(yàn)證是有很亮的條帶的，說(shuō)明P成功了！ 之后我用DpnI消化酶消化模板，操作是說(shuō)明書(shū)上的：nuclease-free water 32ul/10Xbuffer tango 4ul/DNA 2ul/DpnI 1-4ul不等，之后在37攝氏度消化一個(gè)小時(shí)，80攝氏度下20min使酶失活，之后把上述50ul消化體系全部加到感受態(tài)中冰鎮(zhèn)30min,42攝氏度90s熱激轉(zhuǎn)化，再在冰上靜止5分鐘，把轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)直接加到刷選平板上，過(guò)夜之后還是不長(zhǎng)菌，求大神給我指導(dǎo)指導(dǎo)！ PS:我懷疑是感受態(tài)的原因，但是我的感受態(tài)沒(méi)有做多久，而且做的時(shí)候驗(yàn)證了一下是可以用的！ |
2樓2013-12-02 14:36:27
gu03jia
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4樓2013-12-03 11:22:03
彭清LC
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5樓2013-12-15 21:23:56
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