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lihehemumu銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
T4 PNK 和 Ligase 已有1人參與
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實(shí)驗(yàn)是這樣： 試劑公司合成的DNA兩端都是羥基。 我先磷酸化其中一條短ssDNA（A）的5‘，23bases，然后加入另外一條ssDNA（B）15bases，和一個(gè)更短的ssDNA（C）10bases，C與A和B都有部分互補(bǔ)，為的是把A和B拉近進(jìn)行下一步的連接。簡(jiǎn)單的說(shuō)就是要把A和B連接成一條長(zhǎng)鏈。 磷酸化用的是thermo T4 PNK，連接用thermo T4 Ligase。 現(xiàn)在問(wèn)題是連不上，不知道為什么。PNK用37度30min，然后加B和C后雜交2h，再Ligase是22度1h。Buffer用的是PNK的Buffer,跟Ligase相差不大： 10×：500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH 7.6。 另外除了跑膠，還有別的辦法鑒定是否連接上嗎？ 求指導(dǎo)！  |
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海豚的預(yù)言
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2樓2013-12-11 16:12:41
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