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[交流] western boltting技術(shù)求救

目前，本人正在做一個(gè)目標(biāo)基因在各個(gè)發(fā)育時(shí)期和某一時(shí)期各個(gè)組織中的表達(dá)情況分析

在DNA水平，做TR-PCR驗(yàn)證在各個(gè)組織以及不同的發(fā)育時(shí)期均表達(dá)，但是做western blotting分析時(shí)，總沒有目標(biāo)帶出來，用同樣的抗體對(duì)純化蛋白進(jìn)行western blotting分析能出來目標(biāo)帶，不知道大家有沒有遇到這樣的問題？是怎么解決的呢？

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1樓 2013-12-19 23:05:12

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2樓2013-12-19 23:24:30

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jinwei331

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3樓2013-12-19 23:36:27

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cicelyzh

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目標(biāo)蛋白的表達(dá)量低，可以增加上樣量并減小一抗稀釋倍數(shù)。

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4樓2013-12-20 01:49:55

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mlanqiang

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blessing

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6樓2013-12-20 07:58:31

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目的蛋白的表達(dá)量低或者提取蛋白的純度不高
一抗多的話，可以減少一抗的稀釋倍數(shù)

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7樓2013-12-20 09:33:22

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7樓: Originally posted by loveerobin at 2013-12-20 09:33:22
目的蛋白的表達(dá)量低或者提取蛋白的純度不高
一抗多的話，可以減少一抗的稀釋倍數(shù)

目前總蛋白的上樣量是100-150ug，一抗稀釋按1:7500稀釋的，二抗也是按這個(gè)比例稀釋的我們的PVDF膜孔徑是0.45um，300mA濕轉(zhuǎn)了一個(gè)半小時(shí)。會(huì)不會(huì)因?yàn)楸磉_(dá)量低，轉(zhuǎn)膜的時(shí)候轉(zhuǎn)過了呢？

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8樓2013-12-20 09:50:13

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一抗哪家的？這么高的稀釋度？我們一般用CST的才1:1000稀釋

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9樓2013-12-20 10:04:38

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可能是信號(hào)太低檢測(cè)不到，第一，你可以提高抗體濃度，，第二你可以用高靈敏的顯影液

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10樓2013-12-20 10:35:21

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bb123456789: 金幣+1, 做了的，純化蛋白帶能出來，純化蛋白上樣量差不多0.5ug，在相同曝光時(shí)間下帶很明顯 2013-12-20 12:16:36

引用回帖:

8樓: Originally posted by bb123456789 at 2013-12-20 09:50:13
目前總蛋白的上樣量是100-150ug，一抗稀釋按1:7500稀釋的，二抗也是按這個(gè)比例稀釋的我們的PVDF膜孔徑是0.45um，300mA濕轉(zhuǎn)了一個(gè)半小時(shí)。會(huì)不會(huì)因?yàn)楸磉_(dá)量低，轉(zhuǎn)膜的時(shí)候轉(zhuǎn)過了呢？...

有可能是表達(dá)量低，不大可能是轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)過了
一抗稀釋的有點(diǎn)厲害，如果一抗還多的話，減小一下稀釋比例
下次做到時(shí)候，用純化的目的蛋白點(diǎn)一個(gè)樣，做對(duì)照

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11樓2013-12-20 11:15:24

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lidonghong

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gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-12-20 12:29:15

做western blotting分析時(shí)，總沒有目標(biāo)帶出來的時(shí)候，你有沒有做純化蛋白的一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，如果做了且有陽(yáng)性對(duì)照有條帶，那就說明是你蛋白的問題，這樣的原因大多可能是提取的問題（總蛋白濃度如何），也有可能你這個(gè)蛋白是一種豐度非常低的蛋白，wb非常難以檢測(cè)也是有可能的。。。

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13樓2013-12-20 11:48:23

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9樓: Originally posted by yaoxuexuezi at 2013-12-20 10:04:38
一抗哪家的？這么高的稀釋度？我們一般用CST的才1:1000稀釋

自己制備的一抗

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14樓2013-12-20 12:14:11

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13樓: Originally posted by lidonghong at 2013-12-20 11:48:23
做western blotting分析時(shí)，總沒有目標(biāo)帶出來的時(shí)候，你有沒有做純化蛋白的一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，如果做了且有陽(yáng)性對(duì)照有條帶，那就說明是你蛋白的問題，這樣的原因大多可能是提取的問題（總蛋白濃度如何），也有可能你這個(gè) ...

做了陽(yáng)性對(duì)照，有條帶出來我們也考慮是目標(biāo)蛋白豐度的問題，請(qǐng)問有什么方法可以改進(jìn)呢？

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15樓2013-12-20 12:18:10

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bb123456789: 金幣+2, 已經(jīng)重提過了，效果還是不理想目前有一些進(jìn)展了，還在優(yōu)化條件 2013-12-27 09:43:15

引用回帖:

那就只能是提取蛋白的問題
最好是重提
最壞的可能就是表達(dá)量低

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16樓2013-12-20 14:00:12

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簡(jiǎn)單回復(fù)

sjmr12215樓

2013-12-20 05:21 回復(fù)

tang0612樓

2013-12-20 11:21 回復(fù)

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