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yanjinyuan銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
求助overlap技術(shù) 已有2人參與
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大家?guī)兔Ψ治鲆幌�，我要overlap，啟動(dòng)子區(qū)直接從基因組擴(kuò)增約4k，而編碼區(qū)從cDNA上好不容易擴(kuò)增約1k, 回收后條帶都很單一而較亮，但是overlap以后，完全沒(méi)有條帶，試過(guò)touchdown,也不行。大家?guī)兔纯?br />
12.24 ser4 overlap_副本.jpg |
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lvbobo823
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【答案】應(yīng)助回帖
★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-26 13:04:47
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| 你擴(kuò)增的片段有些大，做overlap我們一般都不超過(guò)3kb。你所需啟動(dòng)子比基因區(qū)域大建議你讓這兩個(gè)片段的重疊區(qū)域大一些，另外調(diào)整好這兩個(gè)片段的濃度，一般不要太大稀釋上10倍左右1:1混合。擴(kuò)這大片段選用一些好點(diǎn)的酶擴(kuò)增。若不行建議加個(gè)酶切位點(diǎn)吧。畢竟片段有點(diǎn)大。 |
2樓2013-12-26 11:41:33
yanjinyuan
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3樓2013-12-26 12:19:18
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4樓2013-12-26 13:41:13
yanjinyuan
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5樓2013-12-26 14:13:36
lvbobo823
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
yanjinyuan: 金幣+5, 先謝謝了，我先做了試試，不行再請(qǐng)教啊 2013-12-27 11:28:32
gyesang: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流！ 2013-12-30 14:47:43
gyesang: 回帖置頂 2013-12-30 14:47:51
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gyesang: 回帖置頂 2013-12-30 14:47:51
| 我實(shí)驗(yàn)室之前也有人做overlap模板沒(méi)稀釋擴(kuò)不出來(lái)，稀釋了一下就擴(kuò)出來(lái)了。你的重合堿基就20bp有點(diǎn)少啊，建議加到30bp以上。合成引物時(shí)在找?guī)讉�(gè)合適的酶切位點(diǎn)也合成些引物，防止overlap不工作耽誤時(shí)間，先連載體再酶切連接下一片段。 |
6樓2013-12-27 07:55:39
yanjinyuan
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7樓2013-12-30 14:25:32
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8樓2013-12-31 09:11:41
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