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seo.d_park木蟲 (正式寫手)
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[求助]
求助，cloning大俠 基礎(chǔ)~ 已有3人參與
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我的Vector 和 Insert DNA 在用限制性內(nèi)切酶切完后在0.8% agarose gel 上確認(rèn)了size,切完后size沒問題。 Ligation結(jié)束后 把 提純的DNA在0.8%agarose gel上確認(rèn)，size偏小。 我以為是Insert DNA 和 Vector 的問題，所以把Ligation結(jié)束的DNA 取少量用之前的 restriction enzyme又切了一遍，然后確認(rèn)了size,切完后的size沒問題，就是一進(jìn)行Ligation 然后確認(rèn)size 就偏小。。（本來應(yīng)該在4.8kb左右，但是Band在4kb左右.) vector和 Insert DNA的 size沒問題，就是Ligation結(jié)束后 比理論上的size(Vector size + Insert DNA size) 小，這到底是為什么��？ 以下是我的5個sample Vector size:4679bp Insert size:225bp,675bp,516bp,720bp,390bp Ligation 結(jié)束后理論上應(yīng)該是:4.8kb 5.3kb 5.1kb 5.3kb 5kb cut.jpg uncut.jpg uncut &cut.jpg [ Last edited by seo.d_park on 2014-1-16 at 11:02 ] |
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【答案】應(yīng)助回帖
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首先，你點樣的太多了。你這個可以點0.5的樣混合，取2ul去跑樣。 再者，樣多了就亮，就會成塊聚集在一起，本來不好分的帶更看不出來了。 第三，這種情況我也碰到過，因為質(zhì)粒提出來后有三種形態(tài)，不一定會怎樣。 Ligation結(jié)束的DNA 取少量用之前的 restriction enzyme又切了一遍。 這種做法有不合理的地方，酶切驗證最好換一種酶單酶切。 |
2樓2014-01-16 15:06:32
jkjr111614
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3樓2014-01-16 16:05:16
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4樓2014-01-17 08:36:19
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呃 關(guān)于未酶切質(zhì)粒 大小就應(yīng)該是明顯小于設(shè)計大小 更多的質(zhì)粒是超螺旋的 電泳行為更接近于略小的線性DNA 如果調(diào)整電泳和曝光參數(shù)合適的話 能看見 實際上是3條帶的 呃…… 還有 以后如果跑質(zhì)粒的電泳 建議質(zhì)粒稀釋后上樣 而不是質(zhì)粒原液上樣 那樣會好看一些 質(zhì)粒也不宜上得太多 如果不是為了看下面的酶切跳帶 上個100ng就很過了 如果為了看下面的卸載的條帶大小 建議直接過量上酶切產(chǎn)物 否則下面條帶看不清楚的 如果插入片段里還有酶切的位點 那就更碎了 呃 祝君好運啦 |
5樓2014-01-18 14:19:18
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