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[資源]
核酸抽提原理
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1：核酸抽提原理 簡(jiǎn)單地講，核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。 經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個(gè)合適的裂解環(huán)境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對(duì)核酸的破壞(如 EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 (如 NaCl)等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶；利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時(shí)，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑 (如GIT、GuHCl 等) 裂解的，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。 最常用的純化方法，一是PC 抽提 + 醇沉淀，二是介質(zhì)純化。第一種方法是利用 PC對(duì)裂解體系進(jìn)行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實(shí)現(xiàn)核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項(xiàng)介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是第一種純化方法的一個(gè)變體，省略了 PC操作的麻煩。當(dāng)然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡(jiǎn)單的 PCR。其它雜質(zhì) – 如多糖、多酚等 -的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎(chǔ)上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實(shí)現(xiàn)的。 2：了解你的實(shí)驗(yàn)樣品 如果你研究某個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：該樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對(duì)樣品的特點(diǎn)一無所知，當(dāng)樣品稍微有一點(diǎn)復(fù)雜時(shí)，抽提核酸的實(shí)驗(yàn)就會(huì)碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細(xì)胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時(shí)，只有對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品有所了解，才能正確選擇裂解方法。 絕大部分情況下，使用新鮮樣品可以獲得最好的結(jié)果。對(duì)一些雜質(zhì)含量高的樣品，如果使用新鮮樣品抽提基因組 DNA 是碰到雜質(zhì)殘留過大的問題，可以試一下 -20C保存一天后再抽提的對(duì)策，可能會(huì)有意想不到的效果。樣品如果因?yàn)槟承┰虮仨毾刃斜４�，也要先�?jiǎn)化一下樣品：血液最好只保存有核細(xì)胞；將樣品分割后保存，避免反復(fù)凍融。如果實(shí)驗(yàn)室不具備合適的保存條件，將樣品先裂解后再保存，是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。 3：裂解方法的評(píng)價(jià) 含蛋白酶的裂解方法，可以認(rèn)為是抽提基因組 DNA 的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對(duì)蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進(jìn)作用；同時(shí)，巨大的基因組 DNA是很容易“纏”住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組 DNA“纏”住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使最終獲得的基因組 DNA 的純度更高。另外一個(gè)思路是，如果基因組 DNA 與蛋白質(zhì)“纏”在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優(yōu)勢(shì)，則純化時(shí)以 DNA的形式被保留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢(shì)，則純化時(shí)以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致 DNA 的損失。有些樣品，如肌肉，即使是RNA 抽提，也強(qiáng)烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個(gè)時(shí)候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì))，原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得最大得率和最高純度的基礎(chǔ)。 不使用蛋白酶的去污劑裂解方法，仍然在細(xì)胞基因組 DNA抽提方面有優(yōu)勢(shì)，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇亲罡�，而�?jīng)濟(jì)性及操作簡(jiǎn)單很重要時(shí)�？刂坪昧呀庖�/樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實(shí)現(xiàn)最簡(jiǎn)單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會(huì)比用 PC 抽提的差一些。 高濃度蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法，是抽提 RNA 的首選�？� RNA 的抽提，最重要的是快速裂解細(xì)胞膜，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)“纏”住的問題，因?yàn)槎疾粫?huì)對(duì)以后的純化產(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而迅速抑制住細(xì)胞內(nèi)的 RNA酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。該方法也可用于基因組 DNA 抽提，非�？焖俸�(jiǎn)單，但純度不是很高。 含 CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細(xì)菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。該方法成功與否與兩個(gè)因素有關(guān)：一是 CTAB的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質(zhì)量對(duì)裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因?yàn)榧词故峭还旧a(chǎn)的純度一樣的CTAB，批號(hào)不同，效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時(shí)， CTAB的少量殘留也會(huì)對(duì)酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時(shí)的溫度，多使用65C；但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴(yán)重或者得率太低，可以試一下 37C – 45C 這個(gè)相對(duì)低溫的區(qū)域。 SDS堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA污染的特點(diǎn)�？刂坪昧呀庖�/菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C 會(huì)更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4C靜置一段時(shí)間以及采用 4C 離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量。該方法不一定要使用 PC 純化，但結(jié)合 PC 純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒。RNA的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml)來實(shí)現(xiàn)�？偟母杏X是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的殘留少一些。不過，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外，對(duì)大質(zhì)粒(50 kb 以上)，該方法可能會(huì)有問題。 PCR模板的簡(jiǎn)易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點(diǎn)是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR，非�？焖�。也正因?yàn)椴患兓�，所以，假陰�?(即沒有擴(kuò)增出來的陽性)比例也比較高。該方法最簡(jiǎn)單的裂解液就是水，復(fù)雜一點(diǎn)的就會(huì)含有一些不會(huì)抑制后續(xù)的 PCR 反應(yīng)，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制PCR 反應(yīng)雜質(zhì)的東西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再復(fù)雜一點(diǎn)的就會(huì)含有諸如 Chelex 100之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡(jiǎn)單，多使用溫度的變化來實(shí)現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等。該方法最適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個(gè)樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率，因?yàn)闃悠妨康慕档�，同時(shí)意味著 PCR 的抑制物量的降低。 選擇了合適的裂解液，下一步就是要控制好樣品與裂解液的比例。這個(gè)問題非常重要，但卻沒有獲得足夠的重視。嚴(yán)肅的參考資料，都應(yīng)該會(huì)提供一個(gè)簡(jiǎn)單的比例，如1ml 裂解液可以用于 T mg 組織或者 C個(gè)細(xì)胞；我的建議是，你的樣品量絕對(duì)要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實(shí)驗(yàn)所需的核酸量，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會(huì)比較合理的。不要因?yàn)?1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果 (純度及得率)沒有關(guān)系，然而，在實(shí)際操作中，對(duì)結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時(shí)使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準(zhǔn)的，而不是以核酸含量為基準(zhǔn)，這一點(diǎn)務(wù)必牢記。 4：純化方法評(píng)價(jià) PC 抽提/醇沉淀方法，是一個(gè)永不過時(shí)的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟(jì)、方便。PC抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對(duì)于一般的干凈的樣品 (雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次 PC抽提都會(huì)損失一部分核酸(因?yàn)椴豢赡軐⑺嗳恳迫?，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的最大的問題是不適合大規(guī)模抽提。 PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一個(gè)非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。PC抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會(huì)對(duì)核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實(shí)際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會(huì)部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會(huì)強(qiáng)烈到 DNA變成 10kb 以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動(dòng)混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會(huì)大于 20kb，這個(gè)大小，除了一些特別的要求外，對(duì) PCR和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻 –此時(shí)的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因?yàn)楸椒尤コ鞍踪|(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會(huì)被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組 DNA會(huì)斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4C 離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)。PC 抽提的另外一個(gè)用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA的特點(diǎn)，在 RNA 抽提時(shí)獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點(diǎn)要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用 PC抽提的，否則核酸必定降解。 高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個(gè)非常不錯(cuò)的方法。與 PC抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點(diǎn)外，該方法幾乎克服了 PC抽提的所有缺點(diǎn)。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度 (蛋白質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C會(huì)更好一些。 介質(zhì)純化方法，是一個(gè)越來越受到重視的方法。其最大特點(diǎn)是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因?yàn)槭苋藶椴僮饕蛩赜绊懶。兌鹊姆�(wěn)定性很高 (雖然純度不一定比PC純化方法更高)。其致命弱點(diǎn)是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀(如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因?yàn)榧尤氲囊后w通過離心后會(huì)進(jìn)入另外一個(gè)離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)。不過，介質(zhì)純化方法的成本是最高的。 5：醇的沉淀 醇的沉淀，目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實(shí)現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì) – 主要是鹽 –的分離。實(shí)際操作中，許多雜質(zhì)也會(huì)與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時(shí)候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機(jī)大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。 就核酸而言，標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實(shí)際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達(dá)到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨(dú)使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來(當(dāng)然，得率可能會(huì)降低)。知道這一點(diǎn)的意義在于：不要迷信標(biāo)準(zhǔn)方法的唯一性；相反，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題 – 主要是純度問題 –時(shí)，完全可以通過調(diào)整沉淀?xiàng)l件來改善。最有參考價(jià)值的是 TRIzol提供的一個(gè)沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個(gè)問題就是，要堅(jiān)信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程；調(diào)整醇沉淀的條件，雖然會(huì)降低核酸的得率，但因?yàn)榭梢源蟠筇岣呒兌取?如果核酸抽提的起始樣品是比較“臟”的，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時(shí)，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高時(shí)，效果不明顯，但卻會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。 醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我沒有發(fā)現(xiàn)這二者對(duì)質(zhì)量有大的影響，雖然許多人“發(fā)現(xiàn)”乙醇沉淀的核酸純度更高。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動(dòng)，顏色比較白。這是現(xiàn)象，提示結(jié)論：異丙醇沉淀的核酸不容易丟掉，但比較難洗滌。結(jié)合丟失和洗滌兩個(gè)方面綜合考慮，則建議：少量核酸用異丙醇沉淀 (量少，洗滌不是問題，不丟失為先)，大量核酸用乙醇沉淀(量大，丟失不是問題，洗滌方便為先)。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我沒有碰到過(我?guī)缀醪皇褂玫蜏爻恋�，難道低溫沉淀比較容易出現(xiàn)鹽沉淀？)；我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不徹底。 當(dāng)然，也不要忘記異丙醇沉淀的最大優(yōu)點(diǎn)是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在 1.5ml離心管內(nèi)完成。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時(shí)其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時(shí)間使沉淀最終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質(zhì)量決不會(huì)有問題的。 PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。雖然它們遠(yuǎn)沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點(diǎn)。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。 6：洗滌 洗滌首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時(shí)間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時(shí)(使核酸沉淀最終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。教科書中的操作基本上都是“倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻”，這一描述本身沒有問題，且十分方便，但因?yàn)樗麃碜試?guó)外，自然就有了“水土不服”的問題。如果離心管是經(jīng)過硅化的，因?yàn)橐后w幾乎不掛壁，所以上清可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非�？捎^，其殘留量多到會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。唯一不受管子質(zhì)量影響的操作，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。一定要牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時(shí)去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會(huì)被揮發(fā)去除的。 另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強(qiáng)度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強(qiáng)，洗滌越要徹底：放置時(shí)間相對(duì)要長(zhǎng)一點(diǎn)，洗滌次數(shù)也要考慮增加。最關(guān)鍵的，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇。 7：核酸的溶解和保存 純化后的核酸，最后多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經(jīng)典的 DNA溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認(rèn)為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風(fēng)險(xiǎn)；如果操作過程控制得當(dāng)，DNase的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。 基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。雖然也有部分實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)，-20C 保存的 DNA 比 -70C 保存的穩(wěn)定，我卻寧可認(rèn)為這是個(gè)例。 如果溫度合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個(gè)原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適導(dǎo)致的水解 (RNA在弱酸性更穩(wěn)定，而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個(gè)不為人重視的，就是 EP管對(duì)核酸的影響。首先一定要堅(jiān)信一點(diǎn)，那就是核酸一定會(huì)與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應(yīng)，達(dá)到某種均衡。EP管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導(dǎo)核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時(shí)，這個(gè)現(xiàn)象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時(shí)，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實(shí)驗(yàn)所證明，但許多實(shí)驗(yàn)人員并沒有將該建議當(dāng)回事。 現(xiàn)在制造 EP 管的材料遠(yuǎn)多于過去。這些新出現(xiàn)的材料，在強(qiáng)度、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP材質(zhì)要好許多，但其化學(xué)特征，尤其是對(duì)核酸穩(wěn)定性的可能影響，遠(yuǎn)沒有研究透徹。正如現(xiàn)在的質(zhì)�？梢愿脑斓迷絹碓竭m用某些要求一樣，其負(fù)面產(chǎn)物可能是，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現(xiàn) denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。 [search]核酸抽提[/search] |
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[基金申請(qǐng)] 國(guó)自科面上基金字體 +6 | iwuli 2026-03-12 | 7/350 |
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[基金申請(qǐng)]
今年的國(guó)基金是打分制嗎？
 50+3
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zhanghaozhu 2026-03-14 | 3/150 |
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[考研] 中科院材料273求調(diào)劑 +4 | yzydy 2026-03-15 | 4/200 |
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[考研] 285求調(diào)劑 +6 | ytter 2026-03-12 | 6/300 |
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[考研] 22408總分284求調(diào)劑 +3 | InAspic 2026-03-13 | 3/150 |
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[考研] 材料與化工 323 英一+數(shù)二+物化，一志愿：哈工大 本人本科雙一流 +4 | 自由的_飛翔 2026-03-13 | 5/250 |
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[基金申請(qǐng)] 現(xiàn)在如何回避去年的某一個(gè)專家，不知道名字 +3 | zk200107 2026-03-12 | 6/300 |
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[考研] 材料與化工（0856）304求B區(qū)調(diào)劑 +6 | 邱gl 2026-03-12 | 7/350 |
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[考研] 材料工程調(diào)劑 +9 | 咪咪空空 2026-03-12 | 9/450 |
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[考研] ［0860］321分求調(diào)劑，ab區(qū)皆可 +4 | 寶貴熱 2026-03-13 | 4/200 |
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[考研] 304求調(diào)劑 +7 | 7712b 2026-03-13 | 7/350 |
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[考研] 328化工專碩求調(diào)劑 +4 | 。，。，。，。i 2026-03-12 | 4/200 |
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