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七喜丸子金蟲 (小有名氣)
一枚苦逼的搬磚民工
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[求助]
藥物體內(nèi)生物利用度的測定方案求助 已有1人參與
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本人正在做一個(gè)化合物的體內(nèi)生物利用度的測定，鑒于身邊的師兄師姐沒有這類的經(jīng)驗(yàn)因此來小木蟲求助各位大牛。如能提供幫助小弟感激不盡。 本人預(yù)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備用小鼠做，正式試驗(yàn)用大鼠做。我查閱了很多的文獻(xiàn)，確定了自己測定絕對生物利用度的實(shí)驗(yàn)初步設(shè)計(jì)，但是隨著文獻(xiàn)越看越多，問題也逐步而來，主要的問題有幾個(gè)： 1.給藥劑量的確定。因?yàn)榇饲皼]做過所以該如何確定給藥劑量，我要做口服和靜注該怎樣確定給藥劑量？是要拿兩只小鼠測試一下致死劑量還是如何。 2.需不需要做空白血漿的干擾實(shí)驗(yàn)。就是空白血漿、給藥后血漿（僅取單個(gè)時(shí)間點(diǎn)）進(jìn)HPLC看血漿內(nèi)物質(zhì)是否對藥物出峰產(chǎn)生干擾。此外做干擾實(shí)驗(yàn)的血漿取自小鼠（由于這周沒訂到小白鼠下周我想用小黑鼠可以么……），是否可以將此試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用于拿大鼠做的正式試驗(yàn)中去？ 3.血漿的處理。我查到的有兩種血漿處理方案，第一種是眼球取血后的血漿不加抗凝劑，在冰箱內(nèi)靜置4h，然后取出離心，取上清液渦旋，最后用甲醇沉淀蛋白后進(jìn)樣。第二種是取血前加入枸櫞酸鈉（或用肝素化離心管置血）按照與血漿的體積比1:9抗凝，然后離心，加入乙酸乙酯（分析純）萃取，過濾膜后進(jìn)樣。我的化合物上有一個(gè)五元雜環(huán)連一個(gè)苯，是脂溶性的。在這個(gè)問題中我想細(xì)問幾個(gè)問題： ①加不加抗凝劑有什么影響嗎？為什么有的文獻(xiàn)加了有的沒加…… ②是否需要復(fù)溶？ ③兩種方法哪種更適合我，我知道第一種方法比較麻煩，但是沉淀下來的蛋白和抗凝劑會(huì)不會(huì)對HPLC有干擾等。換種說法，如果將兩種方法中的某些處理步驟互相交換一下是否可行？此外我的師兄（他做體外我做體內(nèi)）試過第二種方法，但是用乙酸乙酯萃取乳化嚴(yán)重，以致酯層很少量，根本吸不上來，那是否連帶乳化的部分也一起吸上來？我怕會(huì)有干擾，而且萃取會(huì)不會(huì)把血漿中的蛋白也萃出來，還是說藥物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血漿的空白背景（比如蛋白，加入的抗凝劑的雜峰）所以影響不大？ ④渦旋的原理是不是就是充分混合，我將渦旋換成37℃恒溫孵育是否可行？ ⑤為什么第一種方法要在冰箱中靜置，室溫下是否可行，37℃下呢？ ⑥第二種方法眼球取血后的血量如何嚴(yán)格控制，因?yàn)樯婕暗桨幢壤渲祁A(yù)先加入的抗凝劑的量。 4.預(yù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)。因?yàn)槲易詈蟮恼皆囼?yàn)想做大鼠，畢竟大鼠的重復(fù)利用度比小鼠要高很多。我預(yù)實(shí)驗(yàn)是打算用小鼠做的，共30只，分成10組以對應(yīng)十個(gè)取血的時(shí)間點(diǎn)（0，5，10，20，30，45，60min和1.5，2，4h）。時(shí)間點(diǎn)有什么需要注意的么？時(shí)間點(diǎn)跨度的長短是要拿本次預(yù)實(shí)驗(yàn)摸條件才能確定么？那么預(yù)實(shí)驗(yàn)我是否口服和靜注都要做還是只做靜注？以及30只每組3只我是問了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是預(yù)實(shí)驗(yàn)需要這么嚴(yán)謹(jǐn)么……改成10老鼠對應(yīng)十個(gè)時(shí)間點(diǎn)是否可行？訂這么多做預(yù)實(shí)驗(yàn)老板會(huì)不會(huì)火兒……其實(shí)我想可不可以多定個(gè)幾十只小鼠代替大鼠直接做正式試驗(yàn)…… 5.正式試驗(yàn)的給藥方法。我打算訂10只大鼠，5只靜注5只口服。有的小木蟲前輩說6只才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，那6只是否是5只給藥1只給生理鹽水作對照？還是都給藥？ 6.正式試驗(yàn)的血樣采集。 ①關(guān)于采血時(shí)間點(diǎn)的確定：我設(shè)計(jì)的是0-12小時(shí)共十個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0，5，10，20，30，45，60min和1.5，2，3，5，8，10，12h），是否需要繼續(xù)在24h和48h采樣?問這個(gè)問題是由于我取血方式的不確定導(dǎo)致的。下面有講到。 ②取血方式的確定。有的文獻(xiàn)說尾靜脈取血，可以取0.5-1ml。但是大鼠多次取血尾靜脈會(huì)不會(huì)引起取血量減少或者血管受損度加大以至于不易取血？導(dǎo)師當(dāng)初給的方案是動(dòng)脈插管取血，但是我擔(dān)心大鼠不能存活12h以上…… 7.HPLC用不用加內(nèi)標(biāo)物，我之前因?yàn)闆]做過所以內(nèi)標(biāo)物并不太懂，比不知道怎么選擇或者是否一定需要內(nèi)標(biāo)物…… 以上為我設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題，有些多，因?yàn)橛行┎椴坏剿跃拖窀魑磺笾?img src="https://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/tuzi/3.gif" align="absmiddle" border="0">之后在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中肯定依然會(huì)有種種問題，希望各位大牛不吝賜教，小弟不勝感激  下周一就要開始正式做了，打算先做血漿干擾試驗(yàn)然后做預(yù)實(shí)驗(yàn)，最后的數(shù)據(jù)處理……PS：小弟只是一名做畢設(shè)的大四學(xué)生，很多知識(shí)肯定被比不上各位大牛蟲友，所以有些問題可能會(huì)簡單到不想回答，不過我還是真誠的懇請各位幫助小弟解答一些問題，不勝感激不勝感激  |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
七喜丸子: 金幣+30, ★★★★★最佳答案, 太感謝了!不過我只是做的本科畢業(yè)設(shè)計(jì)，達(dá)不到發(fā)文章的水平。。 2014-02-24 12:17:32
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七喜丸子: 金幣+30, ★★★★★最佳答案, 太感謝了!不過我只是做的本科畢業(yè)設(shè)計(jì)，達(dá)不到發(fā)文章的水平。。 2014-02-24 12:17:32
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問題很多，但是你的研究目的不是非常明確。你是想發(fā)表文章，還是做新藥申報(bào)材料，還是探索性研究。不同的目的對應(yīng)不同的要求。請先確定自己的目的。 1.給藥劑量的確定。 考慮到已經(jīng)有提取方法的報(bào)道，所以我推測你研究的是一個(gè)已經(jīng)上市的藥物。請查閱這個(gè)藥物的DMPK文獻(xiàn)，最好參照文獻(xiàn)制定的劑量。假如沒有相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)自己定量方法的定量下限來確定劑量，盡量降低研究劑量。沒有必要做毒理試驗(yàn)確定劑量，這既不經(jīng)濟(jì)也無必要。 2.需不需要做空白血漿的干擾實(shí)驗(yàn)。 這個(gè)項(xiàng)目叫分析方法學(xué)專屬性考察，是方法學(xué)研究的一部分。假如是探索性試驗(yàn)，這個(gè)不需要做。因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線里面有空白樣品，一看就知道是否有干擾。但是假如是發(fā)表文章或者是做申報(bào)材料，這個(gè)必不可少。當(dāng)然，只做這個(gè)是不夠的，分析測試方法包含很多項(xiàng)目。做法也有講究，不再細(xì)說。 3.血漿的處理。你兩種方法都可以，取決于你要測定什么樣品的濃度，靜置法測定的是血清濃度，所以不加抗凝劑。加抗凝處理測定的是血漿濃度。兩種濃度和全血濃度都有一定相關(guān)性，不能說哪個(gè)更好，這個(gè)是見仁見智的事情。既然文獻(xiàn)兩種都有報(bào)道，你選擇其一即可。個(gè)人推薦測定血漿濃度。對于取血清的幾個(gè)細(xì)節(jié)問題，不建議用你設(shè)想的方法，主要是考慮到藥品在你所說條件的穩(wěn)定性問題。假如一定要用，需要增加穩(wěn)定性考察，得不償失。眼球取血是個(gè)技術(shù)活，取得好憑這個(gè)能力可以找個(gè)技術(shù)員的工作了，怎么說都沒有用，需要一定的練習(xí)，才能取好。不用擔(dān)心失血的問題，因?yàn)槿蚰阈枰难�，可以壓迫眼球止血的�?br /> 4.試驗(yàn)動(dòng)物的選擇。 先小動(dòng)物后大動(dòng)物是原則，在滿足試驗(yàn)需求的前提下盡量減少動(dòng)物用量。所以還是那句話，看你的試驗(yàn)?zāi)康摹?br /> 5. 大鼠試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)動(dòng)物通常情況下個(gè)體差異較小，因此對于你這個(gè)研究n=6，雌雄各半是可以接受的。沒有必要做空白對照，除非你的待測藥物是體內(nèi)的正常物質(zhì)。假如是體內(nèi)已有物質(zhì)，你空白對照一只也肯定不夠。 6. 采血時(shí)間點(diǎn)的確定。 有沒有這個(gè)藥物的半衰期數(shù)據(jù)？根據(jù)這個(gè)參照自己的劑量和分析方法定量下限制定采樣點(diǎn)。 7. 內(nèi)標(biāo)問題。 這個(gè)依然屬于方法學(xué)開發(fā)方面的問題。建議讀一下分析方法學(xué)驗(yàn)證方面的文章，再來討論。 |
2樓2014-02-24 10:14:42
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