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15944682692新蟲 (初入文壇)
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[求助]
眼含熱淚求助：pcDNA3.1 插入4000bp 質(zhì)粒構(gòu)建，大蝦請(qǐng)留步 已有2人參與
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各位大蝦，兄弟最近忙于質(zhì)粒構(gòu)建，意圖將一段長(zhǎng)約4000+ bp的片段，通過(guò)Not1和EcoR1兩個(gè)酶切位點(diǎn)連接到pcDNA3.1+載體上。情況如下： 1. 通過(guò)inversion AccuPrimeTaq DNA Polymerase High Fidelity酶擴(kuò)增，并純化回收目的片段（引物加酶切位點(diǎn)，保護(hù)性堿基，T7啟動(dòng)子）；由于回收效率很高150ng/ul，下一步雙酶切時(shí)，NEB雙酶切50ul體系，加了7 μl的目的片段*5，22℃12h,再進(jìn)行膠回收。 2. 載體pcDNA3.1也按照以上的體系進(jìn)行雙酶切，時(shí)間為12 h,這次沒有去磷酸化，（之前有過(guò)，也沒連上）。 3. 將酶切后的目的片段和載體進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示大小與預(yù)期相符，亮度相近。 4. 連接時(shí)，NEB T4連接酶，目的片段：載體=5：1，10 μl體系。 5. 感受態(tài)為新買的天根的DH5α。 結(jié)果： 轉(zhuǎn)化后，平板上均有數(shù)量不等的菌落產(chǎn)生，少時(shí)10個(gè)，多時(shí)50來(lái)個(gè)。搖菌擴(kuò)增8 h，提取質(zhì)粒，檢測(cè)組無(wú)陽(yáng)性結(jié)果，有的在1000 bp左右出現(xiàn)條帶，有的在魚對(duì)照未酶切pCDNA3.1質(zhì)粒相同位置2500左右出現(xiàn)條帶。實(shí)驗(yàn)三個(gè)月無(wú)進(jìn)展。 請(qǐng)高手指點(diǎn)迷津。 如果有效果好的、適于長(zhǎng)片段連接的方法，也請(qǐng)大家指教，多謝。 |
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鬼羽帝魂
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5樓2014-02-25 10:01:23
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2樓2014-02-25 08:38:13
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3樓2014-02-25 09:10:01
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4樓2014-02-25 09:50:46
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