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15944682692新蟲 (初入文壇)
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[求助]
眼含熱淚求助：pcDNA3.1 插入4000bp 質(zhì)粒構(gòu)建，大蝦請(qǐng)留步 已有2人參與
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各位大蝦，兄弟最近忙于質(zhì)粒構(gòu)建，意圖將一段長約4000+ bp的片段，通過Not1和EcoR1兩個(gè)酶切位點(diǎn)連接到pcDNA3.1+載體上。情況如下： 1. 通過inversion AccuPrimeTaq DNA Polymerase High Fidelity酶擴(kuò)增，并純化回收目的片段（引物加酶切位點(diǎn)，保護(hù)性堿基，T7啟動(dòng)子）；由于回收效率很高150ng/ul，下一步雙酶切時(shí)，NEB雙酶切50ul體系，加了7 μl的目的片段*5，22℃12h,再進(jìn)行膠回收。 2. 載體pcDNA3.1也按照以上的體系進(jìn)行雙酶切，時(shí)間為12 h,這次沒有去磷酸化，（之前有過，也沒連上）。 3. 將酶切后的目的片段和載體進(jìn)行電泳，結(jié)果顯示大小與預(yù)期相符，亮度相近。 4. 連接時(shí)，NEB T4連接酶，目的片段：載體=5：1，10 μl體系。 5. 感受態(tài)為新買的天根的DH5α。 結(jié)果： 轉(zhuǎn)化后，平板上均有數(shù)量不等的菌落產(chǎn)生，少時(shí)10個(gè)，多時(shí)50來個(gè)。搖菌擴(kuò)增8 h，提取質(zhì)粒，檢測組無陽性結(jié)果，有的在1000 bp左右出現(xiàn)條帶，有的在魚對(duì)照未酶切pCDNA3.1質(zhì)粒相同位置2500左右出現(xiàn)條帶。實(shí)驗(yàn)三個(gè)月無進(jìn)展。 請(qǐng)高手指點(diǎn)迷津。 如果有效果好的、適于長片段連接的方法，也請(qǐng)大家指教，多謝。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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這個(gè)首先如果是酶切后的黏性末端連接效率非常高的。 你這個(gè)實(shí)驗(yàn)流程安排的真不算多效率，還有很大的改進(jìn)的空間。最簡單的，我們實(shí)驗(yàn)室是挑取單克隆稀釋于10uL滅菌水中（超凈臺(tái)操作），然后取2uL菌體稀釋液直接作為PCR模板，另外8uL加入1mL的含抗性的LB培養(yǎng)液直接EP管搖上就可以了。然后PCR結(jié)果出來，菌液差不多搖出來了，看電泳圖分裝菌液、凍存、送測序~~OK，等結(jié)果 看你糾結(jié)這么久，我的Q是429108796，一直解決不了問題的話加我Q詳談吧。這個(gè)做分子實(shí)驗(yàn)不可避免的涉及非常多的藥品試劑的廠家，說這個(gè)會(huì)被小木蟲和諧的，所以~~ |
7樓2014-02-25 13:05:09
shiyiyaya
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2樓2014-02-25 08:38:13
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3樓2014-02-25 09:10:01
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