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linglingerl金蟲 (初入文壇)
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[求助]
CM-sepharose填料處理方法 已有1人參與
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| 我從蘑菇中用沉淀法得到粗蛋白，但是含有很多色素，貌似是陽離子交換層析時色素的影響不大，現(xiàn)在有CM-sepharose填料，但型號未知，但想試試。可是不知道怎么進行填料預(yù)處理。請各位幫幫忙告知具體的處理方法，謝謝！ |
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yipan 
銅蟲 (職業(yè)作家)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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一、準備： CM Sepharose Fast Flow用20％乙醇貯存。將勻漿中乙醇輕輕倒出，用starting buffer代替，使Sepharose與starting buffer的比例分別為75％和25％。（starting buffer中不應(yīng)含有明顯增加其粘性的物質(zhì)）。在裝柱結(jié)束后，柱子應(yīng)當用遞減流速的粘性緩沖液來平衡。 二、裝柱： 1．平衡各物質(zhì)至工作溫度。 2．從膠勻漿中去除氣體。 3．用緩沖液沖洗柱子末端以排除死腔中的氣體。確保柱子過濾網(wǎng)中不含氣體。關(guān)閉柱子出口，并使柱子里含有幾厘米高度的緩沖液。 4．將勻漿連續(xù)倒入柱子中。可以用一根玻璃棒斜靠在柱子壁上，使勻漿沿玻璃棒流入以減少氣泡的產(chǎn)生。 5．立即用緩沖液裝滿柱子的剩余部分，裝上柱子頂部的裝置，并與蠕動泵相連。 6．將柱子與緩沖液相連，打開柱子底部開關(guān)和蠕動泵，以持續(xù)的目標流速（至少400cm/h，如果達不到則以機器的最大流速進行）將膠壓緊。（注：后面的操作不得超過該流速的75％。） 7．在膠床穩(wěn)定后保持該流速，直到流過3倍膠床體積的緩沖液。 【使用活塞】： 1．根據(jù)上述方法裝柱后，關(guān)閉底部出口，移去柱子頂部裝置，小心倒?jié)M柱子至頂部，使液體由于張力而形成上弦的形狀。 2．將活塞以一定的角度插入柱中，確�；钊撞康木W(wǎng)中沒有氣體。 3．在此步驟中將各管道相連，確保緩沖液中不含氣體。 4．緩慢將活塞滑入柱中，從而使活塞網(wǎng)上方以及管中的氣體漸漸被液體代替。入口處的閥應(yīng)轉(zhuǎn)向各個方向以確保排除氣體。 5．鎖定活塞，打開柱子出口，以裝柱流速將緩沖液過柱至膠床穩(wěn)定。（必要時重新調(diào)整活塞位置。） 三、平衡： 在開始純化之前，確保離子交換膠床已被平衡。starting buffer在入柱前及流出后的傳導性和/或PH相同則說明柱子已經(jīng)平衡，可以開始使用了。 |
2樓2014-02-25 16:36:34
linglingerl
金蟲 (初入文壇)
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3樓2014-02-26 18:22:11
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