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yumupeipei銅蟲 (小有名氣)
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細(xì)胞復(fù)蘇 已有2人參與
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一周前，復(fù)蘇了一管甜菜夜蛾中腸脂肪體細(xì)胞，不知為何，細(xì)胞仍未出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象。在倒置顯微鏡下觀察時(shí)，細(xì)胞的外形特征較正常細(xì)胞并無異樣，培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞濃度很大，較活化時(shí)的透光率低，但培養(yǎng)瓶底物無貼壁的細(xì)胞出現(xiàn)（將瓶子豎立時(shí)，培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞也會(huì)隨著培養(yǎng)液向下滑動(dòng) ），請(qǐng)問各位前輩，為何會(huì)出現(xiàn)這種情況？如何提高細(xì)胞的貼壁率？這批細(xì)胞還有必要傳代嗎？倘若傳代的話是否按照懸浮細(xì)胞的方法傳？謝謝！補(bǔ)充：培養(yǎng)基為sigma的Hink's TNM-FH昆蟲培養(yǎng)基，外加10%的牛血清，100單位/ml的青鏈霉素，培養(yǎng)溫度為27度。 |
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建議1-ATCCA上查詢?cè)摷?xì)胞的培養(yǎng)條件，一般細(xì)胞是37度 建議2-確定是貼壁細(xì)胞嗎？如果是，復(fù)蘇第二天還沒有貼壁，可以扔掉了。 建議3-復(fù)蘇時(shí)離心，棄上清，加新培養(yǎng)液，以減小DMSO影響 建議4-看細(xì)胞是不是比正常細(xì)胞蜷縮了，如果是說明已經(jīng)死了，死細(xì)胞怎么放也不會(huì)貼壁了 |
3樓2014-03-25 14:30:37
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一臺(tái)轉(zhuǎn)速可到1500的離心機(jī)，放在細(xì)胞室。復(fù)蘇后細(xì)胞放入10毫升高溫滅菌過的離心管，加培養(yǎng)液稀釋（降低DMSO濃度），在超靜態(tài)內(nèi)封口膜封好離心管口。1000轉(zhuǎn)每分鐘離心5分鐘，（如果凍存管內(nèi)細(xì)胞數(shù)量夠多-比如裝了一瓶25平方厘米的培養(yǎng)瓶的細(xì)胞）離心后底部會(huì)看到一小堆白色細(xì)胞，如果覺得轉(zhuǎn)速不夠可以逐漸增大。棄上清，用新鮮培養(yǎng)液沖出細(xì)胞培養(yǎng)。注意一下，應(yīng)該不會(huì)染菌。我們也是大學(xué)里的細(xì)胞室，跟外面企業(yè)的比起來差得遠(yuǎn)。不知你的細(xì)胞離心會(huì)不會(huì)受影響~  |
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yumupeipei5樓2014-03-25 16:22:07
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silicare: BioEPI+1 2014-03-27 09:34:25
| 樓上說的都很對(duì)啊，我再補(bǔ)充一些。復(fù)蘇的細(xì)胞要在37度水浴鍋里解凍。細(xì)胞完全解凍后不要在水浴鍋里過長時(shí)間的放置，那樣對(duì)細(xì)胞不好。解凍后細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管（我們用的是15ml的離心管）再加5ml的預(yù)熱了的完全培養(yǎng)基，然后離心。離心的轉(zhuǎn)速可以在1000~1500rpm之間。離心完之后的步驟可以按照樓上說的去做~還有一點(diǎn)，細(xì)胞凍存之前的狀態(tài)會(huì)直接影響復(fù)蘇的效果，所以你凍細(xì)胞的時(shí)候要保證細(xì)胞狀態(tài)很不錯(cuò)再凍比較好。最后 祝你下次復(fù)蘇細(xì)胞成功哦~！ |
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7樓2014-03-26 16:21:38
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可以把凍存管放在一次性手套中，剛好可以放在一根手指的那個(gè)位置，裹好了再拿到外面的水浴鍋里。原來我們細(xì)胞間也沒有水浴鍋，還不是拿到外面的水浴鍋解凍的。解凍好之后，拿到細(xì)胞間前在手套上噴點(diǎn)75%的酒精，再取出凍存管到無菌操作臺(tái)中，擰開前用沾有75%酒精的棉球?qū)φ麄�(gè)凍存管進(jìn)行擦拭。擦拭完畢后擰開前在酒精燈火焰上稍微過一下蓋子處。酒精棉不要太濕，不然在火焰上過的時(shí)候容易著火。只要注意規(guī)范操作是不會(huì)出現(xiàn)污染的。如果覺得凍存管從手套中取出來不方便，可以直接用剪刀剪開更好。祝你實(shí)驗(yàn)順利~！ |
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9樓2014-03-31 17:06:29
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