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紫樂喚新蟲 (初入文壇)
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[求助]
真誠(chéng)求助在六孔板做Caco-2細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn) 已有1人參與
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最近在做Caco-2細(xì)胞，接種在六孔板的transwell小室上面，可是都養(yǎng)好長(zhǎng)時(shí)間電阻一直也只有70,80左右，不知道怎么回事 ？ 還有想做成功這個(gè)實(shí)驗(yàn)的好人，多給我說一些做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的小細(xì)節(jié)，因?yàn)榧钡犬厴I(yè)，謝謝各位了 |
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heyi615
新蟲 (初入文壇)
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- 注冊(cè): 2011-08-01
- 專業(yè): 食品科學(xué)基礎(chǔ)
2樓2014-06-04 15:13:21
【答案】應(yīng)助回帖
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這個(gè)原因太多了。因?yàn)檫@個(gè)模型要花很長(zhǎng)時(shí)間，技術(shù)環(huán)節(jié)多，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出問題，結(jié)果就不妙。所以你的問題較難回答。我按自己認(rèn)為重要程度的順序試著不完全的回答： 1. 消化，既要充分又不能過分。 我認(rèn)為消化環(huán)節(jié)是Caco-2模型成功的最關(guān)鍵因素之一。在細(xì)胞融合度大于95%時(shí)進(jìn)行消化，首先用PBS洗滌一下，吸干再加5mLPBS，放進(jìn)培養(yǎng)箱孵育5min，盡量去除培養(yǎng)基；吸干加入胰酶消化5min以上，呈細(xì)沙狀時(shí)，加入4倍以上胰酶體積的培養(yǎng)基，用5mL槍使勁吹打(壯男15下，弱女子吹打20下以上)，計(jì)數(shù)時(shí)觀察細(xì)胞，應(yīng)該都是單個(gè)散在的。如果有2個(gè)或以上細(xì)胞成團(tuán)，說明吹打不夠；如果細(xì)胞大小不一，可能吹打過了。 以250000個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種transwell，隔天換液即可。 2. 污染，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，半開放培養(yǎng)的模型對(duì)無菌操作有很高的要求 無菌操作就不講了 3. 營(yíng)養(yǎng)要求高 高塘DMEM培養(yǎng)基，現(xiàn)加NEAA、谷氨酰胺、FBS(GIBCO)，一瓶用完后再配下一瓶 4.細(xì)胞層很嬌嫩，需要呵護(hù) 換液不能用槍，水流速度太大，需要用10ml移液管。在接種后的第一次換液，尤其要溫柔。 5.測(cè)量電阻的技巧 在培養(yǎng)基中測(cè)電阻一般會(huì)比HBSS中高；在做轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)前夜必須換液；HBSS洗滌一次，電阻會(huì)降一次，如果信心不足，就不要洗3次了；還可洗滌后，在搖床平衡后再測(cè)，電阻會(huì)上升一些。 |
3樓2014-06-05 09:52:08
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