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請(qǐng)問(wèn)WB做成這樣，說(shuō)明人品已經(jīng)極差了嗎？ 已有1人參與
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各位大蟲，中午好！ 我做WB，上了5個(gè)泳道，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖，是內(nèi)參蛋白H3（histone H3，14kDa）和目的蛋白(是兩個(gè)條帶，42kDa和38kDa),藍(lán)色為marker（第一個(gè)圖是內(nèi)參的，第二個(gè)圖是目的蛋白的）。我跑膠了以后沒(méi)有考染，直接做WB，做出來(lái)這樣的結(jié)果。解釋不了為什么會(huì)是這樣的結(jié)果？marker是好的，說(shuō)明不是膠的問(wèn)題。蛋白上樣量150微克（上樣量不能再少了，再少的話我的目的條帶就不清晰了）。而我的目的蛋白WB以后出來(lái)還算勉強(qiáng)，但有點(diǎn)模糊和拖尾。所以我覺得極可能是蛋白的問(wèn)題。 因?yàn)槲也幌肷蠘芋w積太大，總體積約為20微升，所以我打算是10微的蛋白溶液和10微的2×SDS loading buffer，但是最后蛋白上樣量保證150微克的條件下，蛋白上樣體積就會(huì)超過(guò)10微甚至達(dá)到16微，然后剩余的體積我就把加2×SDS buffer補(bǔ)足20微，這會(huì)導(dǎo)致上樣前煮沸的過(guò)程中蛋白沒(méi)有溶解好或沒(méi)有完全溶解嗎，會(huì)造成這樣的結(jié)果嗎？ 提取的植物總蛋白，然后用很劇烈的方式振蕩溶解的，這樣會(huì)對(duì)蛋白有什么影響嗎？ 感謝有經(jīng)驗(yàn)的大蟲，解答問(wèn)題，如果還有可能其他的原因?qū)е逻@樣的結(jié)果，請(qǐng)?zhí)峁┠膶氋F建議或意見，謝謝！  內(nèi)參蛋白H3.jpg 目的蛋白.jpg |
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- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
2樓2014-04-03 12:27:28
3樓2014-04-03 14:38:56
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WB已經(jīng)做完一段時(shí)間，突然想起來(lái)當(dāng)初留下的這個(gè)問(wèn)題。 后來(lái)的解決方案主要如下： 第一，SDS loading buffer一定要按照體積加入，切勿忽視。 第二，蛋白上樣量還是適當(dāng)減少，上樣體積也不要過(guò)多，我把20微上樣體積改成了10微。主要考慮是這樣跑膠的結(jié)果會(huì)比較好很多，當(dāng)然對(duì)WB顯色沒(méi)有太多影響，畢竟抗體對(duì)目的蛋白的信號(hào)放大是數(shù)量級(jí)的。反而條帶顯色更好。 第三，抗體的稀釋比例，對(duì)于我的實(shí)驗(yàn)來(lái)講特別是內(nèi)參的比例很重要，由于使用的國(guó)外比較好的公司的抗體，所以效價(jià)確實(shí)高，最后H3的考題稀釋比例是1：40000。 最后有圖有真相，上圖給需要的朋友參考。 |
4樓2014-04-24 21:07:42
5樓2014-04-24 21:20:55
6樓2018-11-15 23:25:33
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