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416158716金蟲 (小有名氣)
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[求助]
求大神指點(diǎn)qPCR結(jié)果，相對定量，動(dòng)物給藥后各個(gè)個(gè)體表達(dá)相差數(shù)量級，求助~~~~ 已有1人參與
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本人新手做動(dòng)物的RT-PCR檢測試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是動(dòng)物分組造模后，對動(dòng)物進(jìn)行給藥，再檢測動(dòng)物目標(biāo)基因的表達(dá)情況。 選擇的內(nèi)參基因是GAPDH，使用的動(dòng)物組織是肝臟，固定檢測老鼠的某一分頁。 內(nèi)參的delta Rn vs cycle 的線非常集中，這個(gè)是不是代表我的內(nèi)參已經(jīng)沒有問題？ 內(nèi)參的擴(kuò)增曲線 目標(biāo)基因的delta Rn vs cycle線比較層級分布 目標(biāo)基因的擴(kuò)增曲線 但是經(jīng)過系統(tǒng)計(jì)算后的2-ΔΔCT法結(jié)果顯示 從結(jié)果可知，動(dòng)物個(gè)體的目標(biāo)基因表達(dá)十分大，達(dá)到1-2個(gè)數(shù)量級的差別，也就是說最高比最低可能達(dá)100多倍，這種結(jié)果可信嗎？ 對于我的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我也仔細(xì)去分析過問題，首先是內(nèi)參，這是我沿用別人的選擇GAPDH，我也查到很多文獻(xiàn)是拿這個(gè)內(nèi)參進(jìn)行大鼠肝臟PCR實(shí)驗(yàn)的，而且我的delta圖顯示，內(nèi)參在各個(gè)樣本上的擴(kuò)增上相對整齊，Ct大概在15左右，是不是可以得出結(jié)果內(nèi)參沒有問題？ 其次，分析目標(biāo)基因序列問題，目標(biāo)的基因序列是我從NCBI的gene中，通過查找大鼠相關(guān)基因的引物方法找到的，去年利用同樣的序列進(jìn)行過大鼠腦部位的PCR，結(jié)果相對整齊，不會(huì)出現(xiàn)這么懸殊的情況。最近也拿該引物序列在NCBI上重新BLAST了，可以查找到所擴(kuò)增的目標(biāo)蛋白，表面這個(gè)基因應(yīng)該引物序列沒有錯(cuò)誤？？？。從擴(kuò)增的圖可以看出，有的個(gè)體Ct在21-23，有的個(gè)體Ct在28-31，出現(xiàn)這種情況的原因我不太懂。是不是究其目標(biāo)基因在個(gè)體表達(dá)就是存在差異？。但是按這個(gè)Ct值算得的結(jié)果是數(shù)量級差別。這個(gè)Ct的范圍在多大范圍內(nèi)才可信？ 我之前一直懷疑是不是組織內(nèi)的RNA降級了，所以后來又重復(fù)了一批次的動(dòng)物，所有的條件都控制得很好，包括組織從動(dòng)物上取材后，生理鹽水清洗，濾紙吸干，立刻放入冰盒中保存，半小時(shí)內(nèi)存入-20度冰箱，整個(gè)實(shí)驗(yàn)取材流程在4小時(shí)內(nèi)，所有取材完畢后立即放入-80度冰箱保存，提取rna等操作按標(biāo)準(zhǔn)流程。從結(jié)果看，最先取材的空白組，模型組，目標(biāo)基因的表達(dá)都相對較高，其他給藥組反而相對較低，能否說明我組織RNA是穩(wěn)定的？是藥物影響RNA表達(dá)？ 另外從擴(kuò)增的溶解曲線圖發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物的Tm值相對接近，溶解曲線沒有產(chǎn)生任何小峰，所以認(rèn)為特異性比較良好，我這個(gè)想法正確嗎？ 之前也曾經(jīng)懷疑過是不是試劑盒牌子的問題，試過Takara、thermo的qPCR kit，同樣的結(jié)果。 心里有很多疑問： 1. 如果RNA降解了，是不是不但目標(biāo)基因，連內(nèi)參基因也會(huì)受影響？有沒有大神能告訴我，從我的數(shù)據(jù)圖看，我的樣品是否存在問題？ 2. 這個(gè)Ct值在什么范圍才可靠？我的樣品的目標(biāo)基因相對來說，主要集中23-24,28-30,兩個(gè)范圍，而內(nèi)參主要集中在15左右，這能否說明只是樣品本身的表達(dá)造成的？而非引物設(shè)計(jì)，或者其他問題？ 3. 出現(xiàn)這種相差這么大的個(gè)體差異，是否就是動(dòng)物本身就是這樣？求有做過動(dòng)物基因檢測的大神指點(diǎn)指點(diǎn)？ 4. 相對定量PCR發(fā)文章時(shí)采用的統(tǒng)計(jì)方法2-ΔΔCT法，但是我用這個(gè)的結(jié)果相差很大，能否使用其他統(tǒng)計(jì)方法？ 5. 本實(shí)驗(yàn)室使用的是ABI 7500系統(tǒng)及軟件，其中產(chǎn)生的結(jié)果是按照2-ΔΔCT法給出的結(jié)果，相差很大，其中g(shù)raph setting的Y-axis 使用的RAW RQ。看過很多相對定量PCR的數(shù)據(jù)處理結(jié)果圖給出的是Y-axis使用的log10 RQ，基因如果下調(diào)會(huì)產(chǎn)生負(fù)值，但是看一些文章給出的相對表達(dá)的圖都是正值，那么我究竟使用什么圖示比較合理？ 求大神指點(diǎn)迷津，不勝感激。。有些地方可能表述不是很好，求指導(dǎo)�。� |
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416158716: 金幣+20, ★有幫助, 很好的交流，謝謝！ 2014-05-02 00:04:10
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我最近也在做q-PCR,咱們可以相互學(xué)習(xí)一下，我也是半懂半疑，希望能幫到你。 1、內(nèi)參應(yīng)該沒有問題，指數(shù)增長期較集中，Ct值在20左右很好的，你的閾值是自動(dòng)還是自己設(shè)置？Ct值在20左右最好，不要超過30就好（經(jīng)驗(yàn)），你的內(nèi)參與目的基因Ct有點(diǎn)大，你的cDNA稀釋了多少倍？最好先做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，再?zèng)Q定濃度，我的用的稀釋10倍做的。 2、相對定量，差距不在數(shù)量級上吧，哪有100倍，希望你看一下計(jì)算公式及，只是與內(nèi)參的一個(gè)相對值，本人覺得是2倍。 3、溶解曲線單峰說明擴(kuò)增較單一 我做的是植物，也比較淺顯，希望幫到你。 |
3樓2014-05-01 16:03:19
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