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請(qǐng)教用熒光pcr儀如何做lamp擴(kuò)增 已有10人參與
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誠(chéng)心交流基因擴(kuò)增方面的問(wèn)題，比如用熒光定量pcr如何做lamp擴(kuò)增（沒(méi)有l(wèi)amp儀），最好有具體步驟。我也會(huì)把我的lamp體系發(fā)在下面。 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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pennchem
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2樓2014-05-08 06:33:04
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3樓2014-05-08 08:48:42
4樓2014-05-08 12:09:51
5樓2014-05-08 12:10:04
6樓2014-05-09 10:46:04
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
gyesang: 金幣+5, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2014-05-31 16:26:43
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分享給你我之前瀏覽的資料： 1．LAMP引物的設(shè)計(jì) LAMP引物的設(shè)計(jì)主要是針對(duì)靶基因的六個(gè)不同的區(qū)域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc區(qū)以及5’端的Bl、B2和B3區(qū)等6個(gè)不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì)4種引物。 FIP(Forward Inner Primer)：上游內(nèi)部引物，由F2區(qū)和F1C區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補(bǔ)F1C區(qū)與靶基因5’端的Flc區(qū)域序列相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)。 BIP引物：下游內(nèi)部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3’ 端的B2c區(qū)域互補(bǔ)，B1C域與靶基因5’端的Blc區(qū)域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補(bǔ)。 2．?dāng)U增原理 60—65℃是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。因此，DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶。使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。擴(kuò)增分兩個(gè)階段。 第1階段為起始階段，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈。上游內(nèi)部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結(jié)合（如圖B所示），在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動(dòng)鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結(jié)合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補(bǔ)單鏈（如圖C所示）。FIP上的F1c與此單鏈上的Fl為互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。自我堿基配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)（如圖C所示）。以此鏈為模板。下游引物BIP與B3先后啟動(dòng)類(lèi)似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈。迅速以3’末端的Fl區(qū)段為起點(diǎn)．以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是LAMP基因擴(kuò)增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。 第2階段是擴(kuò)增循環(huán)階段。以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合。開(kāi)始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。迅速以3’末端的B1區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板。進(jìn)行DNA合成延伸及鏈置換．形成長(zhǎng)短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，BIP引物上的B2與其雜交。啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增。且產(chǎn)物DNA長(zhǎng)度增加一倍。在反應(yīng)體系中添加2條環(huán)狀引物L(fēng)F和LB，它們也分別與莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動(dòng)鏈置換合成，周而復(fù)始。擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度DNA的混合物。且產(chǎn)物DNA為擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated <wbr>isothermal <wbr>amplification，LAMP） 3 LAMP的特點(diǎn) LAMP與以往的核酸擴(kuò)增方法相比具有如下優(yōu)點(diǎn)： (1)操作簡(jiǎn)單，LAMP核酸擴(kuò)增是在等溫條件下進(jìn)行，對(duì)于中小醫(yī)院只需要水浴鍋即可，產(chǎn)物檢測(cè)用肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)沉淀濁度即可判斷。對(duì)于RNA的擴(kuò)增只需要在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶就可同步進(jìn)行(RT．LAMP)，不需要特殊的試劑及儀器。 (2)快速高效，因?yàn)椴恍枰A(yù)先的雙鏈DNA熱變性．避免了溫度循環(huán)而造成 的時(shí)間損失．核酸擴(kuò)增在l h內(nèi)均可完成，添加環(huán)狀引物后時(shí)間可以節(jié)省1／2，多數(shù)情況在20。30 rain均可檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。且產(chǎn)物可以擴(kuò)增至109倍，達(dá)0.5 mg／mL．應(yīng)用專(zhuān)門(mén)的濁度儀可以達(dá)到實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。 (3)高特異性，由于是針對(duì)靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的4種特異性引物。6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增。故其特異性極高。 (4)高靈敏度，對(duì)于病毒擴(kuò)增模板可達(dá)幾個(gè)拷貝，比PCR高出數(shù)量級(jí)的差異。 缺點(diǎn)：由于LAMP擴(kuò)增是鏈置換合成，靶序列長(zhǎng)度最好在300 bp以?xún)?nèi)。>500 bp則較難擴(kuò)增。故不能進(jìn)行長(zhǎng)鏈DNA的擴(kuò)增。由于靈敏度高。極易受到污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。故要特別注意嚴(yán)謹(jǐn)操作，以及在產(chǎn)物的回收鑒定、克隆、單鏈分離方面均遜色于傳統(tǒng)的PCR方法。 4 引物設(shè)計(jì)實(shí)例 LAMP引物設(shè)計(jì)的在線(xiàn)網(wǎng)站(http://primerexplorer.jp/e/)，只要導(dǎo)入靶基因就能自動(dòng)生成成組引物。 以某一微生物的鞭毛基因?yàn)槔v解一下LAMP相物設(shè)計(jì)的過(guò)程： 首先，單擊瀏覽按鈕選擇靶基因序列文件，靶序列默認(rèn)的是小于2 2 kbp。支持三個(gè)類(lèi)型的文件，普通文本格式（僅含序列）, FASTA格式和GenBank 格式文件。 第二，從下面三個(gè)選項(xiàng)中選擇定參數(shù)設(shè)定（引物設(shè)計(jì)條件）條件�；贕C含量的自動(dòng)判斷, 起始的參數(shù)是特定的：如果GC含量小于或等于45%.，則選取AT豐度高的區(qū),如果GC含量高于60%，則選取GC豐度高的區(qū),其它情況是標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定狀態(tài)。 設(shè)計(jì)合適的引物是進(jìn)行LAMP反應(yīng)的關(guān)鍵，通過(guò)考慮堿基組成，GC含量，二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，Tm值等因素可以通過(guò)Pimer Explore)(一種專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)LAMP引物的軟件)來(lái)設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)的引物。 在進(jìn)行LAMEP引物設(shè)計(jì)的時(shí)候有以下幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)需要考慮： 1.引物之間的距離 F2區(qū)段的5’端到B2區(qū)段的5’端(LAMP反應(yīng)擴(kuò)增的區(qū)域)之間的距離建議是120~180bp。 F3區(qū)段的3’端到F2區(qū)段的5’端之間的距離是0~20bp(同理B2和B3之間的距離是0~20bp)。 F2區(qū)段的5’端到F1區(qū)段的5f端(形成環(huán)的部分)之間的距離是40~60bp。 2.引物的Trn值 引物的Tm值采用近鄰分析法(the nearest-neighbor method)來(lái)計(jì)算，這種方法是目前認(rèn)為計(jì)算值最接近真實(shí)值的一種方法。計(jì)算Tm值的時(shí)候會(huì)受到鹽濃度(salt concentration),寡核苷酸的濃度等實(shí)驗(yàn)條件的影響，所以最好是在確定的實(shí)驗(yàn)條件下來(lái)計(jì)算Tm值。 例如：寡核苷酸的濃度為0.1μmol，鈉離子的濃度是50mM,鎂離子的濃度4 mM等。 Tm(退火溫度=△h*1000/[△S+Rln(C/4)]-273.15+16.6log[Na+] 式中，Tm為退火溫度，℃；為摩爾氣體常數(shù)，1. 987ca1/℃•rnol ； △H為焓變；△s 為熵變；C為寡聚核苷酸的濃度；[Na+]為鈉離子濃度。 對(duì)于GC含量正�；蚴荊C含量富集的引物Tm值為60~65℃，而對(duì)于AT富集的引物Tm值為}55~60℃。在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，F(xiàn)1c和B1c的Tm值大概是65℃(64~66℃), F2,B2, B31的Tm值大概是60℃(59~61℃)。 3.引物末端的穩(wěn)定性 引物的末端作為DNA合成的起點(diǎn)必須有一定的穩(wěn)定性，自由能改變值(△G)是指反應(yīng)物的自由能與產(chǎn)物的自由能之差，反應(yīng)朝著自由能減小的方向運(yùn)行口引物和目的基因之間的退火反應(yīng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的反應(yīng)，自由能改變值(△G)越小，引物與模板之間的退火反應(yīng)越容易發(fā)生。 一般在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的時(shí)候，F(xiàn)2/B2\F3/B3的3’端和F1 c/B1c的5’端的自由能改變值小于或等于-4Kcal/mol。F1C的5’端擴(kuò)增以后相當(dāng)于F1的3’端，所以它的穩(wěn)定性很重要。 4 GC含量 引物在設(shè)計(jì)的時(shí)候使其GC含量介于40%~65%之間，但是當(dāng)引物的GC含量介于50%~60%時(shí)，引物的質(zhì)量相對(duì)好一些。 5.二級(jí)結(jié)構(gòu) 引物在設(shè)計(jì)的時(shí)候要防止形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這一點(diǎn)是十分重要的，特別是內(nèi)引物。 lamp反應(yīng)原理圖.jpg |
7樓2014-05-09 11:15:39
8樓2014-05-09 12:47:02
9樓2014-05-11 00:37:02
xiaoguabu
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10樓2014-08-03 12:13:41
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