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?木木@新蟲 (初入文壇)
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[求助]
跪求PCR大神，解決小弟問題，都一個(gè)多月了，快被折騰死了 已有4人參與
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做兩個(gè)酶的克隆表達(dá)，克隆，測(cè)序，都沒問題， 然后設(shè)表達(dá)引物，用的Pet28a，酶切位點(diǎn)：1號(hào) （ NCO1 和Xho1 ） 2號(hào) （Nhe1和Xho1） 雙酶切，驗(yàn)證，（兩個(gè)酶都是2500多bp），條帶位置正確，載體條帶也正確（單酶切實(shí)驗(yàn)過(guò)，都能切開） 然后：?jiǎn)栴}來(lái)了，就做鏈接，還做了3種比例的鏈接，用BL21感受態(tài)， 挑菌，菌落PCR，要是沒連上吧，應(yīng)該是250bp的一段，要是連上了，應(yīng)該就是和我的目的片段2500差不多， 可是，條帶偏偏是2000不到，去測(cè)序 ，結(jié)果是：結(jié)果顯示，測(cè)序沒有信號(hào)或信號(hào)微弱，測(cè)序結(jié)果不可用，我們將終止此反應(yīng)。建議您重新檢測(cè)模板和（或）更換引物后，重新測(cè)序。 這怎么回事啊，我2500的條帶放進(jìn)去連接，怎么連出來(lái)的不是目的條帶，里面就：雙酶切后的目的基因，28a，T4buffer，T4酶，就沒有了啊 附圖，分別是第一個(gè)和第二個(gè)的菌落PCR，通用引物擴(kuò)的 222.jpg 111111.jpg |
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已經(jīng)有11人回復(fù)
兄弟拜錯(cuò)神了，你的問題不是PCR大神能解決的，你的PCR做的很好嘛 
2樓2014-05-20 19:45:54
zhaodahe
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3樓2014-05-20 22:33:51
luwei13566
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yuefeng506
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8樓2014-05-23 10:10:16
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