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[交流]
兄弟姐妹們來幫我看下根據(jù)這幾個(gè)線索能否確定一個(gè)pcr產(chǎn)物是否為我要的片段
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最近在做RACE，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)了巢式引物A和B，與試劑盒帶的UPM和NUP進(jìn)行巢式pcr，pcr程序設(shè)計(jì)的降落pcr。第一次pcr以引物A和UPM擴(kuò)增，電泳檢測無結(jié)果，以B和NUP進(jìn)行巢式擴(kuò)增，出來兩條帶，一條520左右，一條425。讓生工克隆測序，520這條帶上，找不到我的兩對引物，作為3'末端，也沒有polyA尾巴。（1）而425的這個(gè)片段，能找的我的兩對引物B和NUP，且在序列兩端，（2）該片段有polyA尾巴，（3）而且和我得保守序列有160bp的100%的重疊，再設(shè)計(jì)引物時(shí)，理論上就是160bp的重疊，該特征符合。（4）再設(shè)計(jì)引物時(shí)，B和NUP之間沒有引物二聚體，引物B評分100。（5）pcr用的生工的MIX，所以具體的tap酶啊，Mg離子的濃度都不清楚。但是在對這段基因進(jìn)行blast的時(shí)候，沒有任何的相似結(jié)果，所以很糾結(jié)，根據(jù)上面的五個(gè)線索，該片段是否是我要的目的片段，又會(huì)不會(huì)是擴(kuò)出來的非特異性條帶，我很不明白為什么會(huì)出現(xiàn)非特異性。附上3‘RACE的pcr圖。 3race ifn-1-5-18.jpg |
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2樓2014-05-28 11:26:01
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