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zxlulurain新蟲 (初入文壇)
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CHIP超聲條件請(qǐng)各位做過的大神給點(diǎn)建議 已有3人參與
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| 剛剛開始做chip，實(shí)驗(yàn)室是sonics VCX130超聲破碎儀，探頭是2mm的，要破碎的體積大約是200-400ul，細(xì)胞是sw1990和panc-1，請(qǐng)各位做過chip的蟲友們給出點(diǎn)點(diǎn)子，超聲破碎的條件多少功率，沖擊幾秒，間歇幾秒，幾個(gè)循環(huán)比較合理，可以破碎到所需要的DNA片段。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: MolEPI+1, good ! 2014-07-15 21:56:34
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做ChIP第一步就是去確定超聲的條件，這個(gè)具體超聲參數(shù)肯定是需要自己去摸索的，因?yàn)槊總�(gè)人不同的機(jī)器和材料以及溶劑就有不同的方法。 以下是我個(gè)人總結(jié)的一些超聲需要注意的事項(xiàng)： 1.片段長(zhǎng)度，如果是只做ChIP-PCR的話在200-1000范圍內(nèi)都可以，因?yàn)檫@個(gè)長(zhǎng)度便于擴(kuò)增，而ChIP-seq就得在200-500之間，這個(gè)范圍便于測(cè)序。 2.超聲功率，你需要做幾個(gè)梯度（如10%-60%，或100W-400W），從小到大去測(cè)試，太小不能充分打斷，太大則過度打斷，甚至?xí)^熱、起泡。如果是寧波東芝的可能不太穩(wěn)定，我用的是美國(guó)BRANSON的，很穩(wěn)定，40%比較好。 3.超聲時(shí)間，你需要做幾個(gè)梯度（如1min-5min），這個(gè)是指總時(shí)間，不包括間隔。從短到長(zhǎng)，道理同上，我的是4分鐘。然后一次on的時(shí)間，則1s-30s不等，隨你所好，關(guān)鍵是不要超久過度產(chǎn)熱，會(huì)使你的蛋白變性或起泡，因?yàn)槿芤豪镉斜砻婊钚詣㏒DS。我的是一次超10秒，on的總時(shí)間4分鐘（不包括間隔）。 4.間隔時(shí)間，目的是讓你的之前單次超神產(chǎn)生的熱量冷卻下來，10s-2min不等，一般不比on的時(shí)間短，我的是30s。 5.循環(huán)的總數(shù)，也就是超聲的總時(shí)間，包括間隔，你就根據(jù)3和4自己算一下吧。 6.注意事項(xiàng)：a 雖然你的探頭是最小的2mm，但是我建議你最好體積不要太小，否則探頭容易碰壁或離開液面，散熱也不夠好；b 整個(gè)超聲過程最好再冰水混合浴中進(jìn)行，道理如前； c 我個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，用1.5ml的Ep管超聲不易起泡。 暫時(shí)就想到這么多了，歡迎大家指正。 |
5樓2014-07-02 23:59:56
【答案】應(yīng)助回帖
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gyesang: 金幣+3, 鼓勵(lì)交流！ 2014-06-29 17:23:29
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gyesang: 應(yīng)助指數(shù)+1 2014-07-15 21:55:33
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超聲破碎的時(shí)間和功率最好自己摸索一下，超聲后跑電泳，確保片段的大小集中在500bp-1kb。 根據(jù)你超聲儀的參數(shù)，你可以試試10%功率，打5s停9s，打8-10次。（我的做法是，直接用手拿著，超聲2次放到冰上冷一會(huì)） 一定要保證不能出現(xiàn)氣泡，我的經(jīng)驗(yàn)是 超聲時(shí)探頭位于離心管的底部，但是不能接觸管壁。 |
3樓2014-06-29 16:20:28
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