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571900696金蟲 (初入文壇)
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革蘭氏陰性菌質(zhì)粒提取 已有3人參與
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我手上有一個革蘭氏陰性菌，只測序過基因組，其他信息一概不知，接下來想將質(zhì)粒測序，所以開始提取質(zhì)粒，但是并不確定這個菌是否有質(zhì)粒。 最初用的就是歐米伽的普通的質(zhì)粒提取試劑盒，但是根本沒有條帶，同時提取了別的質(zhì)粒（成功），證明試劑盒和方法操作沒有問題，嘗試多次都沒有。 接下來開始手提，堿裂解法，下面附上方法，請大家?guī)兔匆幌路椒ㄓ袥]有問題，有哪些需要注意和改進(jìn)的地方，謝謝！ 溶液I 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris．Cl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.0) 溶液Ｉ可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細(xì)菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，將兩個微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。 溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋） 1%SDS 蓋緊管口，快速顛倒離心管５次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個內(nèi)表面均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。 溶液Ⅲ 5mol/Ｌ乙酸鉀 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上３－５分鐘。 堿裂解法： １）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于200μl用冰預(yù)冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。 ２）加400μl溶液Ⅱ，快速顛倒5次，以混合內(nèi)容物，切勿渦旋振蕩！將離心管置于冰上。 ３）加300μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ ，反復(fù)顛倒數(shù)次，使之分散均勻，置于冰上3-5min。 ４）4℃12 000g離心5min，將600μl上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。 ５）加等量酚：氯仿， 劇烈振蕩混勻， 4 ℃12000g離心２分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。 ６）室溫下加600μl遇冷異丙醇，劇烈震蕩，室溫下放置2min。 ７）4℃12 000g離心５min，倒掉液體，吸凈！ ８）加1ml 70%乙醇，顛倒數(shù)次，12000離心2min，去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。彈合 ９）加100μl含RNase A的TE緩沖液重新溶解核酸，溫和震蕩，保存于-20℃。 為確保方法和操作沒有問題，也同時提取了別的質(zhì)粒，這次居然出現(xiàn)了條帶，不過只有一條，天然質(zhì)粒不是都應(yīng)該是三條帶嗎？我擔(dān)心這一條帶可能是基因組，所以將基因組和這個可能的質(zhì)粒同時跑膠，就是下圖，第2,3道分別是基因組和提取的可能的質(zhì)粒的條帶，的確不在一條帶上啊，所以就送去測序，不過也不能確定就是質(zhì)粒。（忽略我這塊很丑的膠=。=） 后來的測序結(jié)果就像是啪啪扇我倆大嘴巴子。。。這是結(jié)果：附件是最后一次送樣的樣品檢測報告，因為我們不知道目標(biāo)質(zhì)粒的大小（質(zhì)粒大小一般在1k到100k不等），一旦質(zhì)粒大小達(dá)到20k以上就不能根據(jù)條帶確定是質(zhì)粒還是核基因組。但是根據(jù)我們后期比對的情況證明樣品DNA很復(fù)雜，主要是核基因組污染也比對上一些其他質(zhì)粒，所以DNA是肯定存在嚴(yán)重污染。 側(cè)回來有6M大，肯定不是質(zhì)粒，肯定是基因組污染，現(xiàn)在我很困擾，都要瘋了，這個陰性菌的質(zhì)粒我都提了小倆月了，結(jié)果測序結(jié)果居然這樣！！我提取其它質(zhì)粒都沒有出現(xiàn)過問題，請問是我的手提方法有問題嗎？還是革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素干擾了質(zhì)粒提取，造成基因組污染？我已經(jīng)定了一個歐米伽去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒，還沒有到，如果提出來的仍然不是三條帶我就呵呵了。。。。。。。。之前一直沒有用去內(nèi)毒素的試劑盒是因為普通的試劑盒不就是可以提陰性菌的嗎，大腸就是啊，以為很簡單，結(jié)果一直不停地出問題。。。。。。。 求指教。。。。。。求。。。。。。欲哭無淚。。。。。。   基因組和提取的可能質(zhì)粒.JPG |
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2樓2014-06-20 07:34:59
3樓2014-06-23 09:31:14
571900696
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4樓2014-06-23 10:48:05
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5樓2014-06-23 10:50:07
6樓2014-07-01 23:00:52
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★
kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-07-02 12:26:53
kx444555: 金幣+4, 鼓勵交流 2014-07-02 12:26:53
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看了你的帖子，發(fā)現(xiàn)有幾個問題： 1，質(zhì)粒的跑膠圖片不一定是三條帶的，而是‘理想狀態(tài)下是三條帶’，所以你不必糾結(jié)質(zhì)粒圖片沒有三條帶，看你的圖片，不知道左側(cè)第一條Marker的大小，但目測比對2,3泳道，估計3泳道是質(zhì)粒的可能性比較大。 2，你已經(jīng)知道該G-的基因組，怎么會其他信息一概不知呢？可以查資料了解該種屬的基因組質(zhì)粒特點。 3，你送去的質(zhì)粒測序結(jié)果6M？很奇怪，是切膠回收測序的么？Genebank比對過么？是什么東東？即便是基因組，也可以比對出是什么種屬。 |
7樓2014-07-02 08:38:35
weifensky
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8樓2014-12-20 20:37:55
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9樓2020-01-11 13:44:33
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