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如何提取細胞中各種細胞器？是不是只有密度梯度離心法這一種方法？ 已有1人參與
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最近做個項目要精密提取出細胞中各種細胞器，是否只有密度梯度離心法這一種方法，還有沒有其他更方便高效的方法？ 另外想問一下如果是密度梯度離心，是否在提取細胞器前要將細胞膜破碎？還是細胞拿來直接進行離心就可以把細胞膜破碎掉？ 望知道的大神告訴一下，謝謝！ |
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感謝參與，應助指數(shù) +1
lt840527: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-06-20 12:17:47
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lt840527: 金幣+10, ★★★很有幫助 2014-06-20 12:17:47
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主要有差速離心和密度梯度離心 ：一般是先用差速離心初分離，再用密度梯度離心進一步分離。 以下詳細： 細胞器的分離 細胞由細胞膜、細胞核和細胞質組成，細胞質中含有若干細胞器和細胞骨架等，這些也稱作亞細胞組分。對于細胞的結構和功能的研究，是細胞生物學的基本課題，其重要的研究手段之一是分離純的亞細胞組分，觀察它們的結構或進行生化分析。分離亞細胞組分的方法主要有差速離心和密度梯度離心。 一、差速離心（differentialcentrifugation） 在密度均一的介質中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。 速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀 在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內質網與高基體、最后為核蛋白體。 由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復2～3次效果會好一些。 差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。對于精細的分離，則是密度梯度離心效果更好。 密度梯度離心（densitygradientcentrifugation） 用一定的介質在離心管內形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。 這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。 A等速度沉降，B等密度沉降 二、密度梯度離心 速度沉降（velocitysedimentation）主要用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。這種沉降方法所采用的介質密度較低，介質的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒（細胞或細胞器）在十分平緩的密度梯度介質中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。 等密度沉降（isopycnicsedimentation）適用于分離密度不等的顆粒。細胞或細胞器在連續(xù)梯度的介質中經足夠大離心力和足夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的細胞或細胞器分離。介質的最高密度應大于被分離組分的最大密度，而且介質的梯度要求較高的陡度，不能太平緩。這種方法適于分離細胞器，而不太適于分離和純化細胞。 葉綠體的分離 實驗方法 1.選取新鮮的嫩菠菜葉片，洗凈擦干后去除葉梗和粗脈，撕成小碎塊，稱3g放于玻璃勻漿器中，加入10ml0.35MNaCl溶液，勻漿3～5min。 2.勻漿液用4層紗布過濾于50ml燒杯中。 3.將濾液平分到2個離心管中，天平配平，1000r/min下離心2min。棄去沉淀。 4.將上清液在3000r/min下離心5min。棄去上清，沉淀即為葉綠體。 5.將沉淀用0.35MNaCl溶液懸浮，取一滴葉綠體懸液滴于載片上，加蓋片觀察： ①在普通光鏡下觀察；②在熒光顯微鏡下觀察。 實驗結果 1.普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖型，在高倍鏡下可看到葉綠體內部含有較深的綠色顆粒，即基粒。 2.熒光顯微鏡下，選用藍色激發(fā)濾光片，葉綠體發(fā)出火紅色熒光 參考資料： http://shaohua2011.blog.163.com/ ... 203200821841754143/ |
2樓2014-06-20 09:58:40
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