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littlefinger新蟲 (初入文壇)
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[求助]
離子通道western blot遇到各種問題！各位大神幫忙看一下呀！
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請問各位有沒有做過小鼠腎臟離子通道的western的？最近在做NCC和NKCC2遇到各種問題 第一個(gè)問題是 --- 目的蛋白的條帶有時(shí)候能檢測到，有時(shí)候檢測不到（圖1，盡最大努力調(diào)整對比度亮度，隱約有一點(diǎn)條帶，有時(shí)候什么都看不到），條件都一樣。檢測到的時(shí)候NKCC2總是好幾個(gè)條帶 大部分類似單體和二聚體的分子大小，還有一些雜帶。（圖2） 第二個(gè)問題是 --- loading control 之前一直用b-actin，近期 actin總是出現(xiàn)兩個(gè)條帶（圖3）， 所以就試用了a-Tubulin和GAPDH 結(jié)果非常異常（圖4）。 哪位大神能幫我看看問題在哪里��？ PS. 根據(jù)文獻(xiàn)，離子通道的抗原性差，煮樣的時(shí)候采用60度15分鐘；制樣采用sucrose buffer；低速離心，取上清。 fig.1 NCC NKCC2 .jpg fig.2 NCC NKCC2.jpg fig.3 actin.jpg fig.4 GAPDH Tubulin actin.jpg |
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- 最近做western blot 遇到問題，請各路大神指教
已經(jīng)有8人回復(fù)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
littlefinger: 金幣+3, ★★★很有幫助, 感謝啦~我先去試試！ 2014-06-26 04:55:30
littlefinger: 金幣+3, ★★★很有幫助, 感謝啦~我先去試試！ 2014-06-26 04:55:30
| actin出現(xiàn)兩條帶可能是蛋白樣發(fā)生改變了，我也出現(xiàn)過，原因就是每次上樣的時(shí)候都煮沸15分鐘。煮了幾次之后就兩條帶了，可以重新提樣，抗體沒問題。雜帶多可能是一抗?jié)舛雀吡�，或者封閉時(shí)間不夠，可以延長點(diǎn)封閉時(shí)間然后稍微減少點(diǎn)一抗?jié)舛龋夷愕膎cc背景有點(diǎn)深，我沒做過這個(gè)，但是背景深的話可能是二抗?jié)舛雀吡耍蛘呦吹臅r(shí)間不夠。話說你其他的做的真的漂亮。 |
2樓2014-06-25 09:03:47
littlefinger
新蟲 (初入文壇)
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3樓2014-06-26 04:56:40
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