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[求助]
做RACE老是出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，求助！ 已有3人參與
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我在做RACE擴(kuò)增一個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA，設(shè)計(jì)的基因特異引物可以擴(kuò)增出中間的重疊片段（經(jīng)測(cè)序確證），但是5‘和3’RACE總是做不出來。根據(jù)已經(jīng)擴(kuò)增出的中間片段，設(shè)計(jì)了5‘和3’RACE引物，能擴(kuò)增出條帶，Maker指示的片段大小也和目的片段大小差不多，但是經(jīng)切膠回收，連接轉(zhuǎn)化，挑斑，送菌樣測(cè)序后測(cè)回來的序列在NCBI上比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)相似性較高的老是一些別的東西的序列（如某個(gè)病毒的基因組，或者是某個(gè)東西的核糖體蛋白）。也嘗試換過引物，但是要么擴(kuò)不出東西，要么是空載體，要么是上述那種情況。我用的是試劑盒是SMART™ RACE cDNA Amplification Kit。請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)的高人指點(diǎn)，不勝感激！ [ Last edited by 西門吹雪170 on 2014-6-28 at 12:44 ] |
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2樓2014-06-28 12:07:43
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我們實(shí)驗(yàn)室是統(tǒng)一提的RNA，做的cDNA，也有別的人在用，也有做出來別的基因的全長(zhǎng)的，應(yīng)該沒有問題。避免反復(fù)凍融，我們做的5‘和3’cDNA是用小PCR分裝的，一直放在-20度，現(xiàn)在已經(jīng)放了有兩個(gè)多月。我是在做5個(gè)基因的全長(zhǎng)，特異引物設(shè)計(jì)的退火溫度都不一樣啊，都做出來了，有的800-1000bp的基本上測(cè)序的時(shí)候都讓公司給雙向測(cè)通拼接了，小于800bp的基本都是讓正向測(cè)序，沒有拼接過。有影響嗎？謝謝回帖！ |
3樓2014-06-30 09:09:15
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8樓2014-07-07 21:43:57
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