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mulongyan新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求大家?guī)臀铱纯磜b的膠片，求解決辦法 已有3人參與
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SDS-PAGE濃縮膠4%，12.5%。蛋白Marker。每泳道上樣40μg。首先90V電泳30min，后120V電泳2h。300mM，轉(zhuǎn)膜2h。無蛋白快速封閉液封閉3-5分鐘；加入anti-pepc,anti-rubscio一抗（1:1000）室溫1-4hr。TBST洗滌3次，每次10min。之后二抗（1:3000）孵育1h，TBST洗滌3次，最后TBS洗1次，每次10min 。在保鮮膜上，平鋪膜，加ECL發(fā)光液（29050，Engreen），然后暗室曝光檢測。羊抗兔HRP標(biāo)記IgG。曝光后，膜放進(jìn)麗春紅染色液染色，拍照。 這兩個一抗都是多克隆抗體，每個片子上都出現(xiàn)了其他的條帶？這屬于正�，F(xiàn)象？能不能把其他的條帶去掉呢？ 謝謝，大家  H1(9E971B65NI3FB[BH86Z6.jpg |
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jurkat.1640
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2樓2014-07-04 11:22:18
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3樓2014-07-04 14:27:56
mulongyan
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4樓2014-07-24 11:08:23
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5樓2014-07-24 11:10:04
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【答案】應(yīng)助回帖
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WB出現(xiàn)非特異性條帶的原因與解決方法（2014年7月24日） 1.抗體濃度過高；降低一抗、二抗的濃度。 2.一抗的特異性不足；使用單克隆抗體。3.二抗的非特異性結(jié)合，不加一抗，其他操作不變，即可檢測出二抗的非特異性的條帶是否來自二抗的非特異性結(jié)合；此時(shí)需要重新選擇二抗。二抗也最好使用單克隆抗體。因?yàn)橥环N抗原的多克隆抗體的識別抗原的免疫決定簇也不是唯一的，因此相似的免疫決定簇位于不同的蛋白質(zhì)的可能是存在的，所以無論是一抗還是二抗，使用了多克隆抗體，發(fā)生交叉反應(yīng)的概率都會大大增加。 4.樣品蛋白質(zhì)上樣量過大；降低上樣量。 5.樣品蛋白質(zhì)發(fā)生了降解，降解產(chǎn)物成為了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是單克隆抗體時(shí)更為明顯；避免對樣品蛋白質(zhì)反復(fù)凍融，食用新鮮的蛋白質(zhì)樣品，可以使用蛋白酶的廣譜抑制劑（已經(jīng)有商用產(chǎn)品），必要的話使用分子篩層析或HPLC純化蛋白質(zhì)樣品后再上樣（HPLC不能用于蛋白質(zhì)制備，不過用做WB的量還是能夠提供的）。蛋白質(zhì)發(fā)生了降解，可能會形成新的抗原免疫簇，因?yàn)橐恍﹥?nèi)部序列暴露出了出來，雖然在在WB中，蛋白質(zhì)分子基本上是抗原的序列免疫決定簇決定免疫識別，但是序列免疫決定簇鄰近的氨基酸殘基對于抗原-抗體識別還是起作用的，在使用多克隆抗體時(shí)，這點(diǎn)更為明顯。 6.細(xì)胞傳代過多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變異。使用傳代次數(shù)少的細(xì)胞的表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行對比，并且作為分子篩層析或HPLC的純化標(biāo)準(zhǔn)。 僅供參考。 |
6樓2014-07-24 11:44:26
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