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Bioconjugation的常見方法舉例說明 Bioconjugation是生物大分子與有機(jī)小分子或者生物大分子之間的通過共價(jià)鍵的偶聯(lián)反應(yīng)，以便在兩者之間形成共價(jià)交聯(lián)。 �。�1）碳二亞胺法：最早用于蛋白質(zhì)合成，近幾年來也用于導(dǎo)向藥物的研制。常用的水溶性碳二亞胺是1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亞胺（EDC）。1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亞胺（EDC）能夠催化羧基，使其與氨基縮合形成酰胺鍵，反應(yīng)條件溫和、方便易行，只要蛋白質(zhì)與要偶聯(lián)的標(biāo)記分子及EDC按一定比例混合到一起，室溫下中性pH即可反應(yīng)，一般1-2小時(shí)即可完成。如果需要控制偶聯(lián)到蛋白質(zhì)表面的標(biāo)記分子數(shù)量或者反應(yīng)速度，可以0-4度時(shí)反應(yīng)可以過夜完成，反應(yīng)的溶液的pH可略偏酸性（中性也可）------可以視蛋白質(zhì)穩(wěn)定性而確定。由于蛋白質(zhì)分子表面一般都有Glu和Asp，所以1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亞胺（EDC）對其活化進(jìn)而與標(biāo)記分子的氨基縮合成為穩(wěn)定地酰胺鍵；EDC也可以活化標(biāo)記分子的羧基進(jìn)而與蛋白質(zhì)分子表面的游離氨基縮合成為穩(wěn)定地酰胺鍵。 值得一提的是：1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亞胺（EDC）一般不會修飾酶的活性中心的Glu和Asp。筆者的碩士課題所用的標(biāo)記的酶是A. niger GOD，其活性中心也有Asp、Glu，用EDC作催化劑，連接SMD對活性中心沒有明顯的影響。而且 報(bào)道的酶活性位點(diǎn)標(biāo)記的典型試劑不包括1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亞胺（EDC），可能是因?yàn)榭臻g位阻的關(guān)系，使得EDC嵌入沒的活性位點(diǎn)。由于Asp、Glu在很多的酶的活性中心都有，尤其是A. niger GOD的活性中心是一族氧化還原酶因?yàn)榈幕钚灾行牡囊环N典型模式，所以這一結(jié)論有一定的普便指導(dǎo)價(jià)值。 另外，1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亞胺（EDC）不會引起蛋白質(zhì)分子之間的交聯(lián)和引起蛋白質(zhì)的亞基的解離。利用EDC為催化劑給蛋白質(zhì)分子共價(jià)結(jié)合上有機(jī)分子時(shí)，不會發(fā)生了酶活性喪失、亞基解離和GOD分子間或亞基間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)的現(xiàn)象�？赡艿脑蚴牵簛喕佑|面為疏水氨基酸（Glu、Asp、Gln、Asn都是親水氨基酸），1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亞胺（EDC）在亞基接觸面沒有作用位點(diǎn)；EDC分子量僅191.7，與一個(gè)氨基酸的分子量差不多（蛋白質(zhì)之間、亞基之間不可能以一個(gè)氨基酸作為連接鏈），作為連接臂不夠長且該分子中間部分有兩個(gè)共軛的碳氮雙鍵，使得分子不易彎曲，最重要的是EDC只是形成酰胺鍵的催化劑（不象戊二醛分子本來就是，在交聯(lián)分子產(chǎn)物中戊二醛分子自身成為了額外添加的線型的連接臂），連接反應(yīng)形成了新的酰胺鍵而形成任何新的線型的連接臂，所以蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、亞基與亞基的分子間即使可能發(fā)生彼此間的氨基和羧基形成酰胺鍵的交聯(lián)反應(yīng)，也無法克服彼此接近過程中的空間位阻。換言之，由于空間位阻，1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亞胺（EDC）催化有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)分子或有機(jī)小分子與有機(jī)小分子之間的酰胺鍵形成。 （2）活性酯法:含有羧基的標(biāo)記分子先于如N-羥基琥珀酰亞胺等試劑生成活性酯，再與蛋白質(zhì)表面的氨基偶聯(lián)形成酰胺鍵；或者N-羥基琥珀酰亞胺等試劑活化蛋白質(zhì)表面的羧基，再與含有氨基的標(biāo)記分子偶聯(lián)形成酰胺鍵。 �。�3）戊二醛法：戊二醛是一種雙功能交聯(lián)劑，它的兩個(gè)醛基分別與藥物分子和蛋白質(zhì)的氨基形成希夫氏堿，中間以五個(gè)碳原子連接在一起。這可能是目前最廣泛使用的一種Bioconjugation催化劑，但是對于Bioconjugation而言其缺點(diǎn)是會形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的共價(jià)交聯(lián)，影響蛋白質(zhì)的活性。實(shí)際上，戊二醛會形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的共價(jià)交聯(lián)而作為組織樣品的固定劑在電子顯微鏡樣品制備中早已廣泛應(yīng)用，在這個(gè)領(lǐng)域形成蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)就成為了一種有價(jià)值的特性。戊二醛形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的共價(jià)交聯(lián)的可能的原因：不象1-乙基-3(3-二甲氨丙基）碳二亞胺（EDC），戊二醛分子的中間部分沒有雙鍵都是碳碳單鍵，分子柔性較大，更重要的是，在交聯(lián)分子產(chǎn)物中戊二醛分子自身即成為了額外添加的線型的連接臂，因此可能在參與蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)反應(yīng)時(shí)可能會與兩個(gè)蛋白質(zhì)分子的游離氨基之間形成間隔5個(gè)額外碳原子的兩個(gè)希夫氏堿，而且這一5個(gè)額外碳原子的手臂有相當(dāng)?shù)娜嵝�，那么不同的蛋白質(zhì)分子之間由于分子表面的游離氨基之間形成空間網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)就并不是罕見現(xiàn)象了。 �。�4）琥珀酸酐法：藥物分子的羥基或者氨基首先與琥珀酸酐反應(yīng)形成琥珀酸半酯，此帶有中間體，在經(jīng)過碳二亞胺或氨甲基異丁酯催化，與蛋白質(zhì)形成了酰胺鍵。在蛋白質(zhì)與藥物分子之間加入了琥珀二�；� �。�5）重氮化法：芳香胺能夠與亞硫酸鈉及氯化氫反應(yīng)生成重氮鹽。重氮鹽能夠直接與蛋白質(zhì)分子中的Tyr殘基上的鄰位發(fā)生反應(yīng)，形成偶氮化合物，它亦能與His殘基的咪唑環(huán)或Trp殘基吲哚環(huán)反應(yīng)。該反應(yīng)能夠在pH5-8、水性環(huán)境中進(jìn)行，低溫條件下反應(yīng)迅速徹底，并能夠以多苯偶氮基團(tuán)方式在蛋白質(zhì)和標(biāo)記小分子有機(jī)物之間引入不同長度的連接臂。然而，重氮鍵不夠穩(wěn)定，不少時(shí)候容易斷裂；重氮化法用于Bioconjugation副反應(yīng)多而且難以控制，反應(yīng)混合物中往往會形成過量沉淀；重氮化在Bioconjugation過程中會引入多苯偶氮基團(tuán)，這不僅會出現(xiàn)在蛋白質(zhì)與有機(jī)小分子之間，也可能出現(xiàn)在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間，即在蛋白質(zhì)分子之間形成線型連接臂，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)失去生物活性。 參考文獻(xiàn)： C.M.Niemeyer edits,Bioconjugation Protocols----Strategies and Methods,Huamana Press,2004； 黃維德、陳常慶 ，多肽合成，科學(xué)出版社，1985. 洪濤 主編，生物醫(yī)學(xué)超微結(jié)構(gòu)與電子顯微鏡技術(shù)，科學(xué)出版社，1980,119-120. |
3樓2014-07-28 01:33:20
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