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jingmaoluhan新蟲(chóng) (初入文壇)
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測(cè)定魚(yú)肉中組織蛋白酶B、B+L的酶活，為何后者會(huì)比前者小？
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如題，我的測(cè)定方法如下：1g肉糜加入到冰冷的10ml粗酶提取液中,低溫下均質(zhì)一分鐘，將混合物離心1000g-45min-4℃，過(guò)濾得到上清液。測(cè)定蛋白含量。0.5ml粗酶液（50mm乙酸鈉緩沖液，PH=5.0， 1mmEDTA， 0.2%v/v Triton X-100）與1.25ml反應(yīng)緩沖液（B, B+L：200mm磷酸鈉緩沖液，2mmEDTA，0.05%（w/v）CHAPS， 4mmDTT, pH=6.0；H：200mm磷酸鈉緩沖液，2mmEDTA，0.05%（w/v）CHAPS， 4mmDTT, pH=6.6）反應(yīng)2min，40℃，之后加入0.5ml 20um底物溶液（B底物: Z-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride；B+L底物: Z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride；H底物: L-arginine-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride ），反應(yīng)時(shí)間為10min， 之后加入2ml終止液（100mm氯乙酸鈉，70mm乙酸，30mm乙酸鈉，PH=4.3）終止反應(yīng)。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定，發(fā)射波長(zhǎng)為510（460）nm，激發(fā)波長(zhǎng)為350nm。酶活單位U ，One unit (U) of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that hydrolyses the substrate and releases 1 um AMC per min at 30 ℃. Cathepsins activities were expressed as U/mg of protein. 標(biāo)準(zhǔn)曲線用不同濃度的7-amino-4-methylcoumarin (AMC 7-氨基-4甲基香豆素)溶于終止液中制作。將AMC溶于1ml粗酶提取液+2.5ml反應(yīng)緩沖液+0.5ml水+4ml終止液 中，制成不同濃度的溶液 但是結(jié)果不是很穩(wěn)定，有時(shí)候組織蛋白酶B酶活大于B+L的酶活，有時(shí)會(huì)小于（小于是正常的），這是為什么？請(qǐng)問(wèn)有人遇到過(guò)類似方面的問(wèn)題嗎？跪謝�。�！ |
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