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9955新蟲 (小有名氣)
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[求助]
我又來鳥~\(≧▽≦)/~----要做原生質(zhì)體融合，可以做完原生質(zhì)體然后明天再做融合嗎？ 已有1人參與
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要做原生質(zhì)體單核化融合， 做完原生質(zhì)體可以放著嗎？ 過幾天再用可以嗎？ 會(huì)不會(huì)失活�。� 若果可以存放的話----需要神馬條件��？ 謝謝各位啊 |
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新蟲 (小有名氣)
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2樓2014-07-18 15:54:07
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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BY2細(xì)胞原生質(zhì)體檢測細(xì)胞定位 （1） By-2懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)及保存 液體培養(yǎng)基：（1L） 800ml ddH2O 4.3g MS salt 200mg KH2PO4 30g Sucrose 以KOH調(diào)節(jié) pH至5.8，定容至1L，113度，30分鐘滅菌。 使用前加入 100mg Inositol（肌醇） 1mg Thiamin（VB1）硫胺 2mg Glycine（氨基乙酸） 以上三種一般配置成1000乘的貯存液，過濾后滅菌保存于-20度。 0.6mg 2-4-D（以無水乙醇配置10mg/ml，每100ml BY2液體培養(yǎng)基加入6ul）。加入以上物質(zhì)后的BY2液體培養(yǎng)基放4度保存，不加上述物質(zhì)可以放于常溫。 注：以上為液體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基則加入1%的瓊脂。 培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，以1:20-1:25轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中，135rpm，26度暗培養(yǎng)，4-7天轉(zhuǎn)接一次，長期不用則在固體培養(yǎng)基中，26度暗培養(yǎng)，倒置平板，一個(gè)月轉(zhuǎn)接一次，使用前在液體培養(yǎng)基中活化2-3天。 （2） By2原生質(zhì)體的制備 酶液（10ml） 2% Cellulase R-10（0.2g） 0.2% Macerozyme R-10（0.02g） 0.2% BSA（0.02g） 0.36ul/ml β-mercaptoethanol（3.6ul） 5mM MES（pH5.8） 0.4M Mannitol（5ml體積的0.8M的Mannitol） 1mM CaCl2（100ul體積的0.1M的CaCl2） 1）先于帶刻度的15ml的試管中，稱量固體，于超凈臺(tái)加入MES，mannitol，CaCl2，加ddH2O定容至10ml，搖勻，在于通風(fēng)櫥加入β-mercaptoethanol。 2）懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)接后3-4天，加入于50ml離心管中，1000rpm離心2分鐘，小心地吸棄上清，以漂洗液（0.4M的Mannitol，5mM的MES（pH5.8））小心地漂洗一次，即顛倒混勻離心即可，萬勿劇烈震蕩，600-800rpm離心2分鐘，吸棄上清，加入裂解酶液，輕輕搖勻，轉(zhuǎn)移至干凈的小燒杯中。小燒杯以封口膜封住，再以黑塑料袋包住避光，于搖床上40rpm消化3-4小時(shí)。 3）通過顯微鏡觀察消化的程度，可以后酶解液以40um的Nylon mesh過濾，即用一漏斗與Nylon mesh過濾至10ml的管子中，800rpm離心3分鐘。 4）將原生質(zhì)體以漂洗液（0.4M的Mannitol，5mM的MES（pH5.8））洗1-2遍，再以電轉(zhuǎn)液（0.4M的Mannitol，5mM的MES（pH5.8）），70mM的KCl）洗1-2次，離心速度都為700-800rpm，時(shí)間約為3分鐘。加溶液時(shí)小心地加入，不要用力過猛。最后懸浮于0.5ml的電轉(zhuǎn)液中，通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)器在顯微鏡下估測濃度，通過加電轉(zhuǎn)液稀釋至濃度為2×106個(gè)細(xì)胞/ml，放置冰上保存?zhèn)溆谩?br /> 5）清洗2mm的電轉(zhuǎn)杯，自來水洗兩遍，ddH2O洗兩遍，倒置于吸水紙上，在空的EP管上標(biāo)號(hào)，每管加入400ul原生質(zhì)體細(xì)胞、2ul鮭魚精DNA、10-20ug質(zhì)粒（注：質(zhì)粒必須大提，然后濃縮至1ug/1ul以上），小心地混勻轉(zhuǎn)入2mm的電擊杯中（電擊杯預(yù)先冰浴）。 6）擦凈電擊杯的水，進(jìn)行電擊，參數(shù)如下：電壓：150LV，電阻：50Ω，電容：900uF（電擊的輸出參數(shù)約為140V，14ms；細(xì)胞的存活率為40%，轉(zhuǎn)化效率約為50%）。 7）電擊結(jié)束后，向電擊杯小心地加入1ml的電轉(zhuǎn)液，輕輕地吹打，將細(xì)胞吹打出來，可見部分死細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至EP管中，冰浴30分鐘，4度，900rpm離心2分鐘，收集細(xì)胞。 8）于六孔板加入5%的小牛血清，請搖晃幾秒進(jìn)行封閉，倒出于每孔加入2ml的原生質(zhì)體培養(yǎng)液（可以含適當(dāng)?shù)目股�，抑制�?xì)菌）。 9）上接第7步，吸棄上清后，加入1ml的原生質(zhì)體培養(yǎng)液，用移液器輕輕吹勻，轉(zhuǎn)移至六孔板中，搖勻，蓋上蓋子并標(biāo)記好順序，用報(bào)紙包住放于26度靜置培養(yǎng)（GFP為16小時(shí)，Gus assay則為24小時(shí)）。 10)16度靜置暗培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)移至EP管中，1000rpm離心2分鐘，吸棄上清，留100ul左右，輕輕搖勻，可于顯微鏡下觀察。 注：可以用線粒體燃料，DAPI（以ddH2O溶解成Stock solution（1-5mg/ml）,保存于-20度，用時(shí)1:1000稀釋即可）等染細(xì)胞，30分鐘后以原生體培養(yǎng)液洗1次即可。 原生質(zhì)體培養(yǎng)液（濃度關(guān)系）：使用時(shí)加入MES 0.5× MS salt 液體培養(yǎng)基 0.4M Mannitol 3% Sucrose 5mM MES（pH5.8） |
3樓2014-07-19 15:34:43
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