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fsy3224502金蟲 (小有名氣)
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[求助]
請各位大�？聪抡麄�(gè)過程哪有問題？同源重組基因敲除 已有1人參與
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小2最近一直做同源重組基因敲除，快半年了吧，一直卡在重組質(zhì)粒注入宿主菌那一步！希望各位大人指點(diǎn)下，萬分感謝，下面詳細(xì)說一下： 宿主菌：巴氏桿菌 質(zhì)粒：pWSK29（低拷貝質(zhì)粒，有文獻(xiàn)報(bào)道） 待敲除的目的基因大概1000bp左右，然后設(shè)計(jì)了2對上下游引物，各900bp,1200bp。重組載體構(gòu)建比較順利，分別插入上游，下游，抗性基因（四環(huán)素），大概1周時(shí)間。接下來是感受態(tài)的制備： 于新鮮平板上挑斑于5ml試管中，培養(yǎng)12-16小時(shí)，第二天取2ml接種到100錐形瓶中培養(yǎng)至OD600=0.5，按100U/ml加入透明質(zhì)酸酶，繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。 (1) 將菌液于冰上預(yù)冷 15min，將菌液分裝到預(yù)的 50 mL 離心管中，4℃，8000 r/min，離心 10 min，棄上清； (2) 用滅菌預(yù)冷的 10%的甘油（milli-Q超純水）洗滌菌體 2 次，4℃，10000 r/min，離心 10 min，棄上清； (3) 加入 1.5 mL~2 mL 滅菌預(yù)冷的 10%的甘油重懸菌體，然后按 50 μL/管分裝于滅菌預(yù)冷的 1.5ml 離心管中，-70℃冰箱中保存。 接下來是電轉(zhuǎn)： (1) 將 5 μL（150ng） 重組質(zhì)粒 與 感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至 0.1 cm 冰浴冷的電轉(zhuǎn)化杯中； (2) 設(shè)置電轉(zhuǎn)儀參數(shù)：電壓 2.5 KV/cm，5ms，將電轉(zhuǎn)化杯外面的水擦干后進(jìn)行電擊，電擊完畢后，加入液體培養(yǎng)基將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5 mL 的 EP 管中； (3) 37℃預(yù)熱后轉(zhuǎn)移至 200 r/min 搖床培養(yǎng)活化 2~3 h，使細(xì)菌復(fù)壯； (4) 將菌體懸液涂布于含有 四環(huán)素R (2.5μg/mL)抗性的平板上，每 200 μL 涂布一塊平板； (5) 將平板置于 37℃恒溫培養(yǎng)箱直至液體完全吸收，倒置平板，培養(yǎng) 36~48 h 后觀察結(jié)果。 制備的感受態(tài)經(jīng)過驗(yàn)證是沒有污染的，在電擊之后涂布帶無抗性的平板上均能生長。但是一旦涂布含抗性的平板上就一個(gè)都不長。然后我又想是不是電擊參數(shù)不對，然后又設(shè)置了幾個(gè)參數(shù)：1.6,1.8，2.0,2.2,2.4,2.5kv，電擊后涂布還是沒有生長�？偨Y(jié)出幾個(gè)問題： （1）巴氏桿菌感受態(tài)的效率本來就低（文獻(xiàn)報(bào)道），怎么能制備高效的感受態(tài)？ （2）同源重組是不是由于概率低，需要在同一個(gè)電擊條件下大量轉(zhuǎn)化，才能得到較少的陽性菌株（大腸桿菌例外）？ （3）由于巴氏桿菌莢膜的關(guān)系，很難離心，所以加入透明質(zhì)酸酶，但是還是難以附著到離心管壁，特別在離心第三次的時(shí)候10000r/min也有少量菌體懸浮在液體中，只能用槍頭慢慢選取上清，有沒有一種方法能解決這問題？ （4）最想問的就是，同源重組的概率到底有多大？是不是只有通過大量轉(zhuǎn)化才能得到缺失株？  希望各位大人能細(xì)心看完上面的過程，指點(diǎn)下！萬分感謝 |
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