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wjswj木蟲 (正式寫手)
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轉(zhuǎn)一篇關(guān)于質(zhì)粒DNA提取原理的很棒的文章
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轉(zhuǎn)自bigbear 的博客 這篇文章最早是我的大學(xué)同學(xué)yuut發(fā)在Lifescience版上的 我收藏在了blog里面現(xiàn)在拿出來給大家分享一下 在這兒順便多嘴一句 我覺得大家有任何學(xué)術(shù)方面的問題都可以去Lifescience上討論 我們學(xué)校還是有很多牛人的^_^ 我覺得只要是學(xué)生化的進(jìn)實(shí)驗(yàn)室第一個(gè)要學(xué)的估計(jì)就是小提了 這個(gè)也告訴我們學(xué)做實(shí)驗(yàn)不能只知道怎么做也要知道為什么這么做 所以要多問為什么而不要怕會(huì)被師兄師姐恥笑 記得我們老板說過的沒有可笑的問題只有可笑的回答 從質(zhì)粒抽提談起 堿裂解法從大腸桿菌制備質(zhì)粒，是從事分子生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)室每天都要用的常規(guī)技術(shù)。可以我收研究生十幾年了，幾乎毫無例外的是我那些給人感覺什么都知道的優(yōu)秀學(xué)生卻對(duì)堿法質(zhì)粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因?yàn)椤斗肿涌寺 防锩嬷恢v實(shí)驗(yàn)操作步驟，而沒有對(duì)原理進(jìn)行詳細(xì)的論述。這是導(dǎo)致我的學(xué)生誤入歧途的主要原因。后來我發(fā)現(xiàn)其實(shí)是整個(gè)中國(guó)的相關(guān)領(lǐng)域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老師”也是這個(gè)狀態(tài)。這就不得不讓人感到悲哀了。 我想這恐怕和我們的文化有點(diǎn)關(guān)系。中國(guó)人崇尚讀書，“學(xué)而優(yōu)則仕”的觀念深入人心。經(jīng)常聽到的是父母對(duì)他們的獨(dú)苗說，你只要專心讀好書就可以了。所以這讀書的定義就是將教課書上的東西記住，考試的時(shí)候能拿高分……這就是現(xiàn)代科學(xué)沒有在中國(guó)萌發(fā)的根本原因。如果中國(guó)文化在這一點(diǎn)上不發(fā)生變化，那么科學(xué)是不能在中國(guó)真正扎根的，它只能蛻化成新的“八股學(xué)”。 生命科學(xué)是實(shí)驗(yàn)科學(xué)，它講究動(dòng)手。如果實(shí)驗(yàn)科學(xué)只要看看書就可以了，那我想問有那位神仙看看書就會(huì)騎自行車了？或者聽聽體育老師的講解就會(huì)滑冰了？可是光動(dòng)手不思考，不就成了一個(gè)工匠？一個(gè)合格的生命科學(xué)研究者，需要在這兩方面完善自己。一個(gè)杰出的科學(xué)工作者，是一個(gè)熟知科學(xué)原理并善于應(yīng)用的“藝術(shù)家”。 每個(gè)曾經(jīng)用堿法抽提過質(zhì)粒的同學(xué)，希望你看本文后能有所思考，讓中國(guó)的未來有希望。 為了方便理解，這里羅列一下堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。 讓我們先來看看溶液I的作用。任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那么50mM葡 萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言， 幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+ 和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活 性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實(shí)也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì) 粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話告 訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。有一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。 輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合后使用的。要新從濃 NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很 多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳 的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試 一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)?SDS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁 要問，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一 步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過長(zhǎng)，千萬不要這時(shí)候去接電話，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對(duì)待女孩子一樣），不然基因組 DNA也會(huì)斷裂。基因組DNA的斷裂會(huì)帶來麻煩，后面我再詳細(xì)說明。 每個(gè)人都知道，溶液III加入后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。 最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān) 系。如果在溶液II中不加SDS會(huì)怎樣呢，也會(huì)有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽 析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉 淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是 鉀離子置換了SDS中的納離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中 和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要中和之�；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時(shí)間要短，而 且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以 觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III加入后基因組DNA無法快速?gòu)?fù)性就 被沉淀了，這是天大的誤會(huì)，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶 解的。NaOH本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個(gè)副產(chǎn)物，與它是不是沉 淀下來其實(shí)沒有關(guān)系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。 不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實(shí)還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀， 因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不 然時(shí)間一長(zhǎng)就會(huì)因?yàn)榛烊氲腄Nase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個(gè)全面的介紹。酚（Phenol）對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點(diǎn)，酚與水有 很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會(huì)有大量的酚溶解到水相中，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），應(yīng)此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀 時(shí)就會(huì)被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后 離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來。這時(shí)候如果放到－20℃，時(shí)間一長(zhǎng)反而會(huì)導(dǎo)致大量鹽的 沉淀，這點(diǎn)不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要過分小心了。高濃度的鹽會(huì)水合大 量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀， 就用70％的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個(gè)小時(shí)以上，并用tip將沉淀打碎，就能得 到好的樣品。得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進(jìn)行溶解，不然大 量未降解的RNA會(huì)干擾電泳結(jié)果的。瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時(shí)，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬不要認(rèn)為你看到的是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣 品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來線性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會(huì)看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實(shí)這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別 是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是，有時(shí)候抽提到的質(zhì)粒會(huì)有7－10條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。這里暫不深究。 想說的，終于說完了。謝謝你的耐心。留下一個(gè)思考題，為什么真核生物的基因組DNA不能用堿法抽提？ |
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