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yyc12596新蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[交流]
PMA分化后的THP1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 已有2人參與
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PMA 100ng/ml分化72小時(shí)之后的THP1的生物學(xué)特性仍然近似單核細(xì)胞（形態(tài)學(xué)上已經(jīng)完全是巨噬細(xì)胞了）。 使用Lonza的human monocyte nucleofector kit轉(zhuǎn)染（VPA-1007）. 電轉(zhuǎn)24小時(shí)之后做刺激，收養(yǎng)。 WB驗(yàn)證目標(biāo)蛋白已經(jīng)被敲除。但是糟糕的是目標(biāo)因子的分泌沒(méi)有降低。 首先要考慮轉(zhuǎn)染的過(guò)程問(wèn)題。 |
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3樓2014-08-01 23:24:09
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4樓2014-08-01 23:31:29
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5樓2014-08-01 23:34:47
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找不到消息了，回復(fù)在帖子里吧。 我只將M0分化過(guò)M1，M2。M2沒(méi)有試過(guò)細(xì)分到a,b,c. 操作步驟如下： 獲取小鼠骨髓巨噬細(xì)胞 (1) 購(gòu)買(mǎi)適齡小鼠，買(mǎi)來(lái)后在動(dòng)物房中飼養(yǎng)一周。 (2) CO2處死小鼠。用70%乙醇消毒小鼠皮膚以及剪刀和鑷子，用無(wú)菌的剪刀和鑷子剝?nèi)⌒∈髢蓷l后腿的股骨和脛骨。 (3) 在無(wú)菌的通風(fēng)廚中使用純DMEM培養(yǎng)基、25G針頭、5ml針管沖洗小鼠股骨和脛骨的骨髓細(xì)胞。 (4) 用70µm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾骨髓中脂肪等雜質(zhì)，1200rpm離心10分鐘。 (5) 純DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。每只小鼠的兩條后腿可共得5-7x107個(gè)骨髓細(xì)胞。 (6) 每孔1.5x10-6個(gè)細(xì)胞鋪于6孔板中，加入1.5ml的DMEM培養(yǎng)基+10%FBS+1%P/S+20ng/ml Recombinant mouse M-CSF-carrier-free分化3天。 (7) 3天后，直接加入新鮮的1.5ml分化培養(yǎng)基，繼續(xù)分化3天，第7天得到M0巨噬細(xì)胞。 (8) M0細(xì)胞用10ng/ml Recombinant Mouse IFN gamma繼續(xù)分化24小時(shí)得到M1巨噬細(xì)胞。 (9) M0細(xì)胞用10ng/ml Mouse IL-4 Recombinant Protein繼續(xù)分化24小時(shí)得到M2巨噬細(xì)胞。 |
8樓2016-03-22 12:33:22
lcree
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