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楊仔

鐵蟲(chóng) (初入文壇)

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專(zhuān)業(yè): 抗體工程學(xué)

【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

應(yīng)該是對(duì)的，兩邊對(duì)不上的是載體的MCS，中間完全匹配的是你的目的基因。

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11樓2014-08-07 14:45:18

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人于兩點(diǎn)

銅蟲(chóng) (小有名氣)

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專(zhuān)業(yè): 抗感染藥物藥理

引用回帖:

8樓: Originally posted by songzuowei at 2014-08-07 08:45:50
你這個(gè)測(cè)序，每次測(cè)不一定完全正確有可能會(huì)發(fā)生個(gè)別堿基突變但只要氨基酸不突變即可你把拼好的與原始基因序列比對(duì)一下，只要測(cè)出來(lái)的是你的目的基因序列即可兩邊的還有載體序列啊沒(méi)事的...

恩恩，找到原因了。那大神能解釋一下，引物設(shè)計(jì)時(shí)保護(hù)堿基的作用嗎？謝啦！

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12樓2014-08-07 15:28:53

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happydove

新蟲(chóng) (小有名氣)

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
人于兩點(diǎn): 金幣+5, ★★★很有幫助 2014-08-07 15:47:30

拼接方法：首先下游引物測(cè)序結(jié)果反向互補(bǔ)，和上游引物測(cè)序結(jié)果比對(duì)，這個(gè)你會(huì)吧，各種軟件還有NCBI都可以。
比對(duì)結(jié)果會(huì)有中間一段是重復(fù)的，因?yàn)閺幕虻膬深^測(cè)，都測(cè)了1K多，而你的基因才1K多，肯定會(huì)重復(fù)的。然后把下游引物測(cè)序結(jié)果重復(fù)下面的序列和上游的序列拼接到一塊兒。最后在這條新的序列上找到你的上下游引物，也就找到了你的目的基因。下面的說(shuō)一下分析，找到以后再和你的真正目的基因序列比對(duì)，看看測(cè)序結(jié)果有沒(méi)有問(wèn)題，如果有問(wèn)題，再去看測(cè)序的峰圖是否有問(wèn)題。如果比對(duì)沒(méi)問(wèn)題，ok，測(cè)序是正確的。

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13樓2014-08-07 15:39:15

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songzuowei

木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★
人于兩點(diǎn): 金幣+3, ★★★很有幫助 2014-08-08 11:15:48

引用回帖:

12樓: Originally posted by 人于兩點(diǎn) at 2014-08-07 15:28:53
恩恩，找到原因了。那大神能解釋一下，引物設(shè)計(jì)時(shí)保護(hù)堿基的作用嗎？謝啦！...

首先咱也是菜鳥(niǎo)一個(gè)，這里有點(diǎn)資料，希望對(duì)你有幫助，共同學(xué)習(xí)吧。
克隆PCR產(chǎn)物的方法之一，是在PCR產(chǎn)物兩端設(shè)計(jì)一定的限制酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后克隆至用相同酶切的載體中。但實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)限制酶對(duì)裸露的酶切位點(diǎn)不能切斷。必須在酶切位點(diǎn)旁邊加上一個(gè)至幾個(gè)保護(hù)堿基，才能使所定的限制酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行有效切斷。
下表列舉了15種限制酶，分別比較了各種限制酶在其酶切位點(diǎn)旁邊分別加0、1、2、3個(gè)保護(hù)堿基后的切斷情況。表中的：(-) 為不能切斷；(±) 為不能完全切斷；(+) 為能完全切斷。
結(jié)果顯示，基本上所有限制酶，在其酶切位點(diǎn)旁邊加上3個(gè)以上的保護(hù)堿基后，可以對(duì)其酶切位點(diǎn)進(jìn)行有效切斷。
Enzyme Base Pairs from Terminus
0 1 2 3
Apa I －－ ± +
BamH I － ± + +
BstX I － ± + +
Cla I － ± + +
EcoR I － ± + +
EcoR V － + + +
Hind III －－－ +
Not I －－ + +
Pst I －－ ± +
Sac I － ± + +
Sal I + + + +
Sma I － ± + +
Spe I + + + +
Xba I － ± + +
Xho I －－ ± +

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14樓2014-08-07 16:57:02

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人于兩點(diǎn)

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引用回帖:

14樓: Originally posted by songzuowei at 2014-08-07 16:57:02
首先咱也是菜鳥(niǎo)一個(gè)，這里有點(diǎn)資料，希望對(duì)你有幫助，共同學(xué)習(xí)吧。
克隆PCR產(chǎn)物的方法之一，是在PCR產(chǎn)物兩端設(shè)計(jì)一定的限制酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后克隆至用相同酶切的載體中。但實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)限制酶對(duì)裸露的酶切位 ...

謙虛了，大神。

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15樓2014-08-08 11:17:34

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新蟲(chóng) (初入文壇)

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引用回帖:

測(cè)序結(jié)果怎么統(tǒng)計(jì)呢。我們做表格統(tǒng)計(jì)來(lái)源時(shí)是把所有列出來(lái)的來(lái)源都寫(xiě)上去嗎？還是自己隨意挑選一個(gè)

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16樓2014-12-10 16:44:16

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