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sw.arker銅蟲 (初入文壇)
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[求助]
C18柱之前的樣品酸化產(chǎn)生沉淀 已有1人參與
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| 蛋白質(zhì)在蛋白酶消化后，要對其進(jìn)行酸化，然后上C18柱純化；但是我不論用0.1%TFA還是FA酸化樣品都產(chǎn)生沉淀，造成了很多的樣品損失；我用的是FASP方法，Microcon YM-30 (Millipore, Cat. No. 42410)，也就是說沒被消化的蛋白和trypsin會被膜濾掉的。請不吝賜教，多謝！ |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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我提點個人的建議： 1.C18柱是反相層析柱，即柱的介質(zhì)是疏水的18碳烷基共價結(jié)合在硅膠柱上，所以要掛上柱應(yīng)該是使用極性的流動相，掛上了柱再用非極性的流動相把蛋白質(zhì)樣品從疏水的疏水的18碳烷基基團(tuán)上擠下來獲得樣品。 2.TCA和FA酸化后形成的蛋白質(zhì)沉淀不一定就損失了。可以過濾收集已有的沉淀，可以加入蒸餾水并且低溫下用超濾離心管超濾去掉酸后，必要的話可加入少量的弱堿加以調(diào)節(jié)值pH。之后還有沉淀未溶解用表面活性劑重新溶解然后上樣，考慮到生物大分子的可能大幅度的變性（小幅度的變性可能對于C18柱上柱還有幫助，因為可以使蛋白質(zhì)更多的暴露的疏水面）可能，一般不推薦單純使用酸性和堿性強(qiáng)的流動相，因為變性雖然使蛋白質(zhì)更多的暴露的疏水面，但是可能影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和造成蛋白質(zhì)的聚合。 3.既要酸化蛋白質(zhì)（至少可以使其暴露出一些疏水表面），又要避免蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚合怎么辦？可以用加入樣品的上樣液中一些去垢劑或表面活性劑；如果有必要的話，在流動相也可以加入少量的去垢劑或表面活性劑（后者一般不用，除非流動相進(jìn)柱出現(xiàn)柱子被堵的情況，或者該種設(shè)備的流動相配方里的確有少量的去垢劑或表面活性劑）。 加入去垢劑或表面活性劑進(jìn)入樣品的上樣液的理由如下： 去垢劑或表面活性劑是具有親水基又具有疏水基的物質(zhì)，能夠在低于臨界膠束濃度（Citical Micelle Concentration ，簡稱：CMC）時有效結(jié)合于蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域，因此一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分陰離子、陽離子和中性去垢劑等多種類型，中性去垢劑在蛋白提取中應(yīng)用的較多。 一般考慮對于生物大分子的層析，適宜使用中性去垢劑或生物表面活性劑。 中性去垢劑 又稱非離子表面活性劑，對蛋白質(zhì)的變性作用影響較少，宜于蛋白質(zhì)或酶提取之用。一般市售中性去垢劑有聚乙二醇類，如 PEG200；多元醇類表面活性劑，如 山梨醇、司 盤類和吐溫類；聚氧乙烯脂肪醇醚，如芐澤類、平平加類；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如 Igepal CO、乳化劑 OP、Triton、Pluronic(用作消泡劑、潤濕劑、增溶劑)、泡敵。 也可以用天然表面活性劑 又稱為生物表面活性劑，包括種類較為廣泛，如各種樹膠（阿拉伯膠、杏膠、桃膠、果膠）、明膠、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、 瓊脂、海藻酸鈉、酪蛋白、膽甾醇、膽 酸類、多糖類（如環(huán)糊精）等。 這樣蛋白質(zhì)樣品暴露出疏水面在流動相中被去垢劑或表面活性劑占領(lǐng)，通過疏水的18碳烷基時，去垢劑或表面活性劑會有相當(dāng)多的比例的分子因為競爭而被18碳烷基擠走，做個比喻：大強(qiáng)盜（18碳烷基）趕走了小強(qiáng)盜（去垢劑或表面活性劑）占領(lǐng)了地皮（蛋白質(zhì)的疏水表面），如此暴露出疏水表面的蛋白質(zhì)就掛在疏水的18碳烷基的基團(tuán)上。 另外上C18柱時，流動相的極性和離子強(qiáng)度應(yīng)該比較強(qiáng)才容易上柱。洗脫時正好相反，而且可能再次用到表面活性劑或咪唑之類的疏水性試劑。 洗脫時請同時考慮硅膠介質(zhì)的酸堿耐受范圍。 |
2樓2014-08-24 17:21:49
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【答案】應(yīng)助回帖
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新的解答：入6M鹽酸胍或者8M尿素的方法進(jìn)行溶解，配置TFA/鹽酸胍緩沖溶液的方法是：以配制1升為例，稱取高純度的鹽酸胍579.2g（6mol），用0.1%（體積分?jǐn)?shù)）三氟乙酸緩沖溶液加 1.C18柱是反相層析柱，即柱的介質(zhì)是疏水的18碳烷基共價結(jié)合在硅膠柱上，所以要掛上柱應(yīng)該是使用極性的流動相，掛上了柱再用非極性的流動相把蛋白質(zhì)樣品從疏水的疏水的18碳烷基基團(tuán)上擠下來獲得樣品。 2. 用0.1%TFA還是FA酸化樣品都產(chǎn)生沉淀，造成了很多的樣品損失的問題，可以用增加蛋白質(zhì)樣品的溶解度的方法。具體可以用加以溶解，并且定容至1L，混合后，經(jīng)過0.45μm水系微孔濾膜過濾，超聲波脫氣10min。 |
3樓2014-12-29 09:49:04
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4樓2014-12-29 09:50:53
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